202918. lajstromszámú szabadalom • Eljárás savas ureáz előállítására
1 HU 202 918 B 2 (3) pH-optimuma és pH-stabilitása A 29. ábra szerint az enzim pH-optimuma 3. A 30. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet 37 °C hőmérsékleten különböző pH-értékeknél 30 percig pihentettük. Amint az a 30. ábrából látható, az enzim 5 és 8 közötti pH-értékeknél stabil. (4) Hőmérséklet-optimum és hőmérséklet-stabilitás A 31. ábra szerint az enzim hőmérséklet-optimuma 70-75 °C. A 32. ábrán tüntettük fel a maradék aktivitást, miután az enzimet pH - 4-nél és pH - 6-nál 30 percig pihentettük. Amint az a 32. ábrából látható, az enzim pH - 6-nál 70 °C-ig, pH - 4-nél 65 °C- ig stabil. (5) Inhibitorok Amint az a 17. táblázatból látható, az enzimet a higany(II)-klorid és az acetohidroxámsav gátolja. 17. táblázat Inhibitor Koncentráció Relatív aktivitás (%) nélkül 100,0 HgCh 0,05 mM 0,0 Jódecetsav 10,00 mM 99,0 Acetohidroxámsav 10,00 mM 7,9 (6) Molekulatömeg Sephadex G-200-as gélszűréssel meghatározva az enzim molekulatömege mintegy 230 000. (7) Izoelektromos pont Poliakrilamid gélen végzett izoelektromos fókuszálással az enzim izoelektromos pontja 4,5. (8) Kristályszerkezet Az enzim nehezen kristályosítható. (9) Elemanalízis Nem végeztünk a kristályosítási nehézségek miatt. (10) Km Az enzim Km-értéke 4,8 mM (pH - 3, 0,1 mól citrátpuffer). 1. Vizsgálati példa A 3-5. példában előállított C, D és E savas ureázok enzimaktivitását mértük úgy, hogy a reakcióoldat különböző koncentrációkban etanolt is tartalmazott. Amint az a 18. táblázatból látható, ezek az ureázok a kaibamidra gyakorolt hatásukat 20 vagy 50 % etanol jelenlétében is képesek kifejteni. 18. táblázat Savas ureáz Relatív aktivitás % Etanol-koncentráció % 0 20 50 C savas ureáz 100 84,2 51,6 D savas ureáz 100 85,0 50,4 E savas ureáz 100 82,6 47,6 2. Vizsgálati példa Az 1., 2., 6., 7. és 8. példában előállított A, B, F, G és H savas ureáz, valamint a Canavalia Adans ureáz koncentrációit 10 U/ml-re állítjuk be, és ezeket az enzimaktivitásokat vizsgáljuk 20 % etanol jelenlétében, 20 °C hőmérsékleten. Az eredményeket a 19. táblázatban tüntettük fel. 19. táblázat Savas ureáz Relatív aktivitás (%) A savas ureáz 100,0 B savas ureáz 95,0 F savas ureáz 107,0 G savas ureáz 119,7 H savas ureáz 121,6 Canavalia Adans ureáz* 0,5 * Megjegyzés: A Canavalia Adans-ból nyert ureáz, amelynek pH-optimuma 7,0, a P.L. Biochemicals, Inc., UDA cég terméke. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás savas ureáz előállítására - fizikokémiai tulajdonságai a következők: (1) hatása: 1 mól karbamidból és 1 mól vízből 2 mól ammóniát és 1 mól szén-dioxidot termel, (2) szubsztrátspecifitása: a karbamidra hat, (3) pH-optimuma és pH-stabilitása: pH-optimuma 1,5 és 5,5 között van, pH 6-8 között 37 °C-on 30 percig stabil, (4) hőmérséklet-optimuma és hőmérséklet-stabilitása: hőmérséklet-optimuma és pH-optimumán 55 ‘C és 75 *C között van, pH 6-nál 50 ”C hőmérsékletig 30 percig stabil marad, (5) inhibitorai: higany(II)-klorid és acetohidroxámsav gátolja, (6) molekulatömege: gélszűréssel meghatározva 100 000-250 000 dalton között, (7) fajlagos aktivitása: a pH-optimumon, 37 'C-on legalább 20 U/mg fehéije -azzal jellemezve, hogy megfelelő tápközegben tenyésztünk valamely a Lactobacillus fermentum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus reminis, Streptococcus bovis, Streptococcus mitior vagy Streptococcus salivarius fajhoz tartozó mikroorganizmust, majd a tenyésztőfolya-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
