202886. lajstromszámú szabadalom • Eljárás inzulin-származékok előállítására
1 HU 202 886 B 2 1. példa Sertés eredetű deznonapeptid-proinzulin tripszines emésztése fenol jelenlétében, illetve fenol nélkül a) összehasonlító kísérlet 350 mg sertéseredetű deznonapeptid-proinzulint savasán feloldunk, és az oldatot 215 ml 0,1 mól/1 koncentrációjú Tris-pufferhez (pH-7,5) adjuk, amely 200 pg szarvasmarha eredetű tripszint tartalmaz. Néhány perc leforgása alatt az oldat zavarossá válik. A reakció lefolyásának szemléltetésére 2. ábraként a reakcióelegy extinkciós görbéjét csatoljuk. A végtermék nehezen oldódó vegyület, így előrehaladó reakcióval az extinkció növekszik. Az ábrán látható, hogy a választott pH-tartományban a nehezen oldódó termék (inzulin-Aig-Aig) képződik. A reakció befejezte után (mintegy 1 óra) 100 pg tripszininhibitort adunk a reakcióelegyhez, az elegyet centrifugáljuk, és a fehér csapadékot 20 ml 0,05 mól/1 koncentrációjú ammónium-acetát-pufferben (pH-4,0) feloldjuk, 0,1% alkalmas detergens hozzáadásával. Az oldatot kationcserélő oszlopon 0-tól 1 mól/1 koncentrációra növekvő konyhasó gradienssel tisztítjuk. Az alábbi termékeket különítjük el: 96 mg (36,6%) tiszta inzulin-ArgB31-ArgB32-OH-72 mg (27,4%) olyan keverék, amely inzulin-Arg 3’-Arg3-OH és inzulin- Arg -OH elegye, végül két szennyeződés (izoelektromos fokuszálás és HPLC után). A reakcióelegy felülúszó részéből 56 mg (mintegy 21%) keveréket nyerünk, komponensei: 14,9% kiindulási anyag, 8,7% di- és monoarginin-származék, 49,3% dez-alanin(B30)-inzulin és 12,2% dezoktapeptid-inzulin. Emellett a HPLC még néhány kisebb, nem azonosított csúcsot mutat. Találmány szerint Párhuzamos kísérletben 100 mg sertéseredetű deznonapeptid- proinzulint savasan feloldunk, és az oldatot 50 ml 0,1 mól/1 koncentrációjú trisz-pufferhez (pH-7,5) adjuk, amely 2,5 mg/ml m- krezolt és 50 pg szarvasmarha eredetű tripszint tartalmaz. A kristályok 5-15 pm méretű, éles élű hasábokat alkotnak. Három órával később megszakítjuk a reakciót a leírt módon, és a reakcióelegyet a fentiek szerint feldolgozzuk. Hozamok: 56 mg (74,7%) inzulin-Ala^-Arg831- ArgB32-OH 11 mg (14,7%) diarginin- és monoarginin-származék elegye Inzulin-(Árg)2-H aminosavelemzése számított talált számított talált Asp 3 3,29 Thr 2 1,87 Ser 3 3,06 Glu 7 7,99 Pro 1 1,16 Gly 4 4,33 Alá 2 2,34 Val 4 2,88 Cys 6 4,05 fie 2 0,91 Leu 6 6,48 Tyr 4 4,16 Phe 3 3,00 Lys 1 1,00 His 2 2,10 Arg 3 2,94 B31 B32 A 2. ábra a termék (humáninzulin-Arg -Arg OH cink nélkül) extinkciós görbéjét mutatja 25 mM-os acetát-foszfát-pufferben a pH érték függvényében. Látható, hogy az izoelektromos pont körül az extinkciónak éles maximuma van, ami az oldhatóság minimumának felel meg. A 3. ábra a reakcióelegy (humáninzulin- ArgB31-ArgB32-OH) nagynyomású folyadék kromatogramját (HPLC) mutatja, és felismerhető, hogy a kiindulási anyag teljesen eltűnt, monoarginininzulin nyomokban van, gyakorlatilag az egész kiindulási inzulin céltermékké alakult. 2. példa r B31 Humáninzulin-Arg -OH E. coli-ban kifejeződött majom-preproinzulinból tripszines emésztéssel történő előállítása 10 mg majom eredetű preproinzulint savasan feloldunk, és az oldatot 0,5 mól/1 konyhasót, 1,5 mg/ml fenolt, 0,7 mg/ml m-krezolt és 25pg szarvasmarha eredetű tripszint tartalmazó, 0,1 mól/1 koncentrációjú foszfátpuffer 5 ml-jéhez (pH-6,8) adjuk. A termék kiválik a reakcióelegyből, 5-20 pm méretű, éles élű kristályok alakjában. A kristályok 93% inzulint és inzulin-származékot tartalmaznak, ezen belül (HPLC) 78% humáninzulin-ArgB31-OH-t és 14% humáninzulin-Arg831-ArgB32-OH-t. A tiszta felülúszóban az inzulinhoz hasonló proteinek 5%-nál kisebb mennyiséget tesznek ki. Ha a kristályos szuszpenziót tripszin jelenlétében további két napon át szobahőmérsékleten állni hagyjuk, az inzulin és inzulin-származékok elméleti mennyiségének még mindig 87%-a kristályos állapotban van jelen, ezen belül 79% humáninzulin- ThrB30-ArgB31-OH és 11% humáninzulin- ThrB3°AtgB3,-ArgB32-OH. Aminosavelemzés számított talált számított talált Asp 3 2,91 Thr 3 3,04 Ser 3 3,12 Glu 7 7,20 Pro 1 0,96 Gly 4 3,82 Alá 1 1,02 Val 4 3,46 Cys 6 5,41 Ile 2 1,65 Leu 6 6,10 Tyr 4 3,90 Phe 3 3,00 Lys 1 J,01 Arg 2 2,11 His 2 1,94 B31 A 4. ábra a termék (humáninzulin-Arg -OH) extinkciós görbéjét mutatja a pH érték függvényében. Itt is látható az éles maximum, amely mutatja, hogy a humán-inzulin-Arg oldhatósága a fiziológiai pH körül erősen csökken, azaz a termék a találmány szerinti célra alkalmas. 3. példa Humáninzulinin-LysB31-AtgB32-OH előállítása a megfelelő (E. coli-ban exprimált) proinzulin-származékból tripszinnel végzett bontás útján 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
