202883. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-interferon előállítására és tisztítására
1 HU 202 883 B 2 A jelen találmány tárgya eljárás nagytisztaságú, nemimmunogén, antivirálisan és immunregulátorként hatásos, homogén a-interferon előállítására valamint alkalmazására. Az interferonok testjellemző proteinek, amelyek a legkülönbözőbb fajokban kimutathatók. A nekik tulajdonított antivirális és immunszabályzó tulajdonságok már korán a legkülönbözőbb felhasználási területekre alkalmasaknak mutatták őket. Vizsgálatok kimutatták, hogy különböző interferon-osztályok léteznek. Az a-, ß- és y—interferonok mellett röviddel ezelőtt felfedezték az (o-interferont, és szerkezetét is felderítették. Az interferonoktól, mint vírusos betegségek és rák ellen hatásos szerektől remélt nagy elvárások már korán elvezettek természetes anyagból származó interferonkészítményekkel végzett vizsgálatokhoz, amelyeknél azonban súlyos mellékhatások léptek fel. Az ezeknél a vizsgálatoknál használt készítmények még a leggondosabb tisztítás után is különböző interferonok és sok esetben más proteinek komplex keverékeit tartalmazták. Az ok az, hogy az interferonok némelyikének esetében altípusok léteznek, amelyek egymástól többé vagy kevésbé különböznek; így például a-interferonból időközben 20-nál több típus lett ismeretes. Csak az interferonok géntechnológiai eljárások segítségével való előállításával vált lehetővé, hogy típustiszta interferonkészítményeket vizsgáljanak. Ide számítanak a klinikai vizsgáitokban használt (aA-nak is nevezett) rekombináns a2-interferonok is. Döntő jelentőség jut az emberi proteinek mikroorganizmusokkal való előállításánál a proteinek tisztításának. Minden olyan szennyeződés, amely a gazdaszervezettől ered, a termék emberen való alkalmazásakor olyan immunvédelmi reakciókhoz vezethet, amelyek életveszélyesek lehetnek. Az ilyenfajta szennyeződések elválasztása manapság már alig okoz problémát, és az időközben rendkívül érzékennyé vált analitikai módszerek endotoxinokat legcsekélyebb koncentrációban is ki tudnak mutatni. Az interferonkutatás területén is kifejlesztettek olyan tisztítási eljárásokat, amelyek lehetővé teszik azt, hogy olyan interferonkészítményekhez jussunk, amelyek jók, és semmilyen endotoxint nem tartalmaznak. Példaként említhetjük itt von Staehelin és mtsai munkáját [J. Bioi. Chem. 256. 9750 (1981)]. Minden klinikai vizsgálatra használt rekombináns a-interferon gyakorlatilag endotoxinmentes. Annál meglepőbb volt ezért a mellékhatások fellépése, amelyek még az interferonkezelés félbeszakítását is kikényszerítették. Néhány rekombináns a-interferon meglepő módon immunogénnek bizonyult. Az interferon elleni antitestek stimulálódtak. [Quesada et al., J. Natl. Cancer Inst. 70, No. 6, 1041-1046 (1983); Protzman et al., J. Immunol. Methods 75, 317-323 (1984)]. Ezek az antitestek veszélyes következményeket okozhatnak, ha az interferon hatását befolyásolják. Ekkor nemcsak a rekombináns a-interferonra hatnak, hanem - mivel a rekombináns a-interferon a testjellemző interferonnal azonos - ugyanilyen mértékben a testjellemző interferonra is. Végzetes következmény, hogy ezek az antitestek az interferon-kezelés befejezése után is tovább hatnak, a betegség lefolyását súlyosbíthatják, a vírusfertőzések elleni testjellemző védekezést gyengítik, és a szervezetet ezáltal további fertőződésekre hajlamossá teszik. Ezeket a következményeket már állítkísérletekben megerősítették. Maximális gyógyszerbiztonság érdekében arra kell törekdeni, hogy a rekombináns a2-interferon típustiszta, gyakorlatilag endotoxin-mentes és nem utolsósorban nem-immunogén legyen. A jelen találmány feladata tehát az, hogy eljárást bocsásson rendelkezésünkre nem-immunogén, antivirálisan és immunregulátorként hatásos rekombináns ainterferon előállítására. Az említett a-interferonok immunogenitásának oka nem ismeretes. Hacsak nem az, hogy ezért endotoxikus elegyrészek felelősek. A vizsgálathoz felhasznált készítmények elsődlegesen abban különböznek, hogy aminosavszekvenciájukban csekély változások vannak. 23. aminosav 34. aminosav I. készítmény lizin hisztidin II. készítmény arginin hisztidin III. készítmény arginin arginin A klinikailag felhasznált proteinek primer szerkezetében levő szerkezeti különbségek mellett ismeretes, hogy géntechnológiailag előállított a-interferonok esetében mindig az interferon monomer, kismolekulasúlyú, redukált és oligomer formáinak keverékéről van szó (lásd például a 108 585., 110 302. és 118 808. számú nyilvánoságra hozott európai szabadalmi bejelentéseket). Ezen formák némelyike in vitro azonos, mások azonban csökkent hatásokat mutatnak, és néhányat lehetséges immunogén tulajdonságok miatt rossznak tartanak (lásd 108 585. és 110 302. számú nyilvánosságra hozott szabadalmi bejelentéseket). Ezekben a szabadalmi bejelentésekben leírnak eljárásokat ezeknek az interferon-formáknak az elválasztására. A 108 585. számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben leírnak egy eljárást egy lassan vándorló monomer („slow moving monomer”) és oligomerek elválasztására, amelynek során az interferon mintát 3-tól 5-ig terjedő pH-nál bizonyos ideig 28- 40 °C hőmérsékleten inkubálják. A 110 302. számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentés egy olyan eljárást ír le, amelynek során az oligomerekből egy redox-rendszerrel végzett redukcióval a monomer keletkezik. A 83 734 számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentésben leírt kristályos humán-leukocita-interferon esetében a polietilénglikol lecsapószemek interferonnal képzett kristályairól van szó, nem pedig tiszta, homogén és kristályos interferonról, amint azt a címből hinnünk kellene. A 118 808. számú nyilvánosságra hozott európai szabadalmi bejelentében végül rekombináns a-interferont fémkelátgyanták segítségével tisztítanak meg az oligomer formáktól. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
