202595. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az emberi alfa-1-foetoproteinnel kapcsolódó egér monoklonális ellenanyag előállítására
1 HU 202 595 A 2 A találmány tárgya eljárás emberi alfa-l-foetoproteinnel (AFP) kapcsolódó egér monoklonális ellenanyag előállítására. A monoklonális ellenanyagok magas specifitású, nagy tisztaságú szexológiai reagensek, melyeknek előállítási módszerét elsőként Kohler és Milstein ismertette (1975, Natwe, 256,495). A monoklonális ellenanyagok előállításának lényeges újdonsága a hagyományos, ún. poliklonális ellenanyagtermeléssel szemben, hogy nem élő állat szervezetében lezajló folyamat; e célra előállított hibrid sejtek termelik az ellenanyagot A poliklonális ellenanyagtermelés során az ellenanyagképződést kiváltó anyag (fehérjemolekula, mikroorganizmus, vérsejt stb.), azaz az antigén több - esetenként több száz jellemző helyével reagáló ellenanyag keverék képződik. A monoklonális eljárások a lehetséges ellenanyagok egyenkénti termelését oldják meg. Az alfa-foetoprotein (AFP) a magzati élet során a szérum fő fehérje komponense, úgy mint felnőttkorban az albumin. Szerepe nem tisztázott esetleg az anyai szervezetben zajló, a magzat elleni immunválaszt szuppresszáló folyamatokban lehet szerepe [Peck, A. B. és munkatársai, J. Immunoi., 128,1134 (1982) és Littmann B. M. és munkatársai, Cell. Immunoi., 30, 35 (1977)]. Az AFP az alfa-globulinok közé tartozó 70- 72 000 móltömegű glikoprotein. Megjelenését és koncentráció-változását a magzati szérumban a magzatvíz és az anyai szérum AFP szintjének arányos változása kíséri. A központi idegrendszer egy veleszületett rendellenessége a velőcső záródási rendellenesség, melyet az AFP értékek rendellenes szintje kísér, így ilyen kóros magzatot hordozó anya vérszérumában az AFP szint a normálishoz képest emelkedett. Az eltérés a terhesség 16-18. hete között már szignifikáns és jellemző a magzat kóros állapotára. Az ilyen magzatok nagy része életképtelenül születik, vagy az enyhébb esetben 5 éven belül meghal, súlyosan szellemi fogyatékos és mozgássérült Lényeges tehát a korai diagnózis és az orvosi beavatkozás. Az AFP meghatározására poliklonális és monoklonális ellenanyag egyaránt alkalmazható. Természetéből adódóan a poliklonális ellenanyag keresztreakciói lényegesen gyakoribbak, elsősorban albumin zavarhatja a vizsgálatot, amikoris ez a hatás csak bonyolult és költséges tisztítási lépésekkel eliminálható. Az AFP - ellenanyag kapcsolódás a meghatározási módszer specificitásának alapja. Szükség van ezen kívül - sorozatban alkalmazható, gyors módszereknél - arra, hogy az antigén-antitest kötődést jól mérhetően detektáljuk. Az általánosan alkalmazott két módszer radioaktív anyaggal végzett immunreakció vagy az immunreakció enzimes reakcióval való kapcsolása. Utóbbi célszerűbb olyan esetekben, ahol decentralizált a meghatározási módszer használata, és nem számíthatunk valamennyi esetben az izotóp technika körülményeire és műszereire. Az immunreakció enzimes reakcióval történő kapcsolásának modem módja az ún. sandwich enzim-immun teszt Ennek lényege, hogy a keresett anyaggal reagáló két specifikus, de egymástól eltérő ellenanyagra van szükség, melyek részben a keresett anyag különböző antigéndetermináns helyeivel reagálnak, másrészt egyenként más-más mellékfeladatnak felelnek meg. Az egyik ellenanyag jól kötődik plasztikfelületekhez és kötött állapotban is megtartja immunaffinitását, a másikhoz a detektáló rendszer enzime jól kapcsolható, és az ellenanyag-enzim komplexben nem vész el az ellenanyag megfelelő hatékonyságú antigénkötő képessége. A tesztben plasztiklaphoz kötik az első ellenanyagot, ez reagál az antigén egyik determinánsával, majd a megkötött antigént kimutatják a másik ellenanyaggal, mely az antigén másik determinánsával reagálva a rendszerbe viszi a vele kötésben lévő detektáló enzimet. Az enzimhez szubsztrátot adva az enzimes reakció lezajlik és a keletkező színes termék nagy pontossággal fotometriás úton meghatározható. Az AFP bizonyítottan több (hét vagy hat) antigéndetermináns hellyel rendelkezik, ennek megfelelően a monoklonális technikával több különböző független specifitású ellenanyag állítható elő, ezek bármelyike az AFP kimutatására, mennyiségi meghatározására biztonsággal alkalmas. Ezek közül alkalmasan megválasztott, egymástól eltérő specifitású ellenanyagpár a specifikus reakció érzékeny és gyors detektálását szolgálhatja. AFP-vei kapcsolódó monoklonális ellenanyagot írt le Stenman [J. Immun. Meth., 46, 33 (1981)] és Uotila [Mól. Immunoi., 77,791 (1980)]. Az ellenanyagtermelő hibrid sejteket BALB/C egerek AFP-vel történő hiperimmunizálása után nyerték, az állatokból származó lépsejtek mielóma sejtekkel (SP2/0-Agl4) történő fúziója útján. A keletkező - szaporodóképes - hibridsejtek közül a kívánt specifitású ellenanyagot termelő (ún. pozitív) sejtek gyakorisága felhasznált lépenként legfeljebb 1-2 sejt volt, ezen antigén esetében gyakori a teljesen eredménytelen kísérlet. Az ellenanyagtermelés több kívánalma miatt - mely szerint az ellenanyag legyen nagy affinitásé, legyen olyan változat, mely plasztikfelülethez kötve és másik, mely enzimmel képzett komplexében tartja meg immunaktivitását - a hibridizáció után nyert pozitív hibridek között is tulajdonságuk szerinti válogatás szükséges a termelésre alkalmas sejtvonalpár előállítására. Amennyiben egy előkészítő lépés találatszáma alacsony, ez arányosan rontja a megfelelő sejtvonalpárhoz vezető szelektálás lehetőségét, így végeredményben az előállítható sejtvonalpár minőségét Kísérleteink során meglepő módon azt találtuk, hogy két egértörzs keresztezése után kapott FI generáció - immunizálás után - magas specifitású és magas affinitásé ellenanyagot termel. Nem várt módon az ilyen állatok lépsejtjeiből nyert hibrid (hibridóma) sejtvonalak megtartják azt a tulajdonságukat, hogy nagy mennyiségben termelik a magas specifitású és magas affinitásé anyagot Tovább fokozható az ellenanyagtermelés eredményessége, ha a lépsejtek kivételét megelőző immunizálás során megváltoztatjuk az antigén adagolásának programját és a szokásos ismételt immunizálás helyett a folyamatot immunizálási ciklusokból építjük fel. A találmány tárgya eljárás AFP enzim-immunteszthez alkalmas ellenanyag vagy ellenanyagpár előállítására. A találmány szerint az ellenanyag(ok) előállításánál AxDB A2 Fi hibrid egértörzset alkalmazunk. Ugyancsak a találmány tárgya új immunizálási eljárás; az Ft hibrid egértörzset ciklikusan váltakozó AFP antigénbeviteli móddal immunizáljuk. A tumorsejtekkel hibridizált lépsejtek klonjai közül kiválasztjuk a specifikus ellenanyagtermelőket. Azegyes klónokkal nyert monoklonális ellenanyagokat 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
