202591. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a BU-3420T antibiotikum, valamint ilyen antibiotikumot tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
19 HU 202 591 B 20 A tisztítás vázlata Szűrlet Fermentlé pH-értéke 7,2 Extraháló oldószer: etil-acetát Dicalite-on szűrjük A fázisokat elkülönítjük A micéliumolcat elvetjük Vizes szerves Kormatográfia Dicalite-on Hexán toluol B 25-40 frakciók Sephadex LH-20 1:1 kloroform/metanol elegy metanol C Folyadékkromatográfia vákuumban 1 Kloroform 2% metanol/kloroform 3% metanol/kloroform ] Gyűjtjük BU-3420T 5% metanol/kloroform Módszerek és anyagok Az összes oldószerek rcagens-tisztaságúak voltak, és ezeket további tisztítás nélkül alkalmazzuk. Az etil-acetátot, hexánt, toluolt, metanolt és kloroformot a Fisher Scientific Company cégtói szereztük be ÁCS minőségben. A tctrahidrofurán stabilizálószertől mentes, nagy tisztaságú oldószer (gyártója: American Burdick and Jackson Laboratories, Inc.). Víz céljára házilag ionmentesített vizet alkalmazunk, amelyet Bamstead Nanopure IID3700 Series töltetű ionmentesítő rendszeren vezettünk át (így ASTM, CAP, NCCISI típusú, reagens-tisztaságú vizet kaptunk). Az ammónium-acetátot ACSHPLC reagens minőségben a Fisher Scientific Company cégtől szereztük be. A Dicalite a Grefco, Inc. cég (Torrance, Kalifornia) által előállított diatomaíöld. Vékonyréteg-kromatográfia (VRK) A VRK-vizsgálatokat szilikagéllel előre bevont GHLF lemezeken végezzük (előállítója az Analtech cég, méretük: 2,5 cm x 10 cm, a réteg vastagsága 0,25 mm). A lemezeket 6,4 cm külső átmérőjű, 11,5 cm magasságú üveghengerekben fejlesztjük ki (gyártó: a Whatman, Inc. cég). Az edényeket Whatman #4 minőségű szűrőpapírral béleljük, 10 ml, 1 rész metanolt és 9 rész kloroformot tartalmazó elegyet töltünk bele és a lemez behelyezése előtt egyensúlyozzuk. A kifejlesztett lemezeket levegőn szárítjuk és permetező reagens alkalmazása nélkül, látható fényben vizsgáljuk. Elemzés túlnyomásos (HPLC) folyadékkromatográ- 5 fiával Elemzés céljára HPLC-rendszerünket az alábbi komponensekből állítjuk össze: Waters Associates Model 6000A oldószeradagoló szivattyú; Hewlett-Packard 1040A HPLC detektorrendszer, amelynek alkatrészei: 10 HP95B számítógép, HP9121 hajtótárcsa, 7470A kijelző és 2225A vékonysugaras kinyomtató; Water Associates Model U6K injektor; Q-BEX #10015 ODS (10 p.) oszlop (belső átmérője 4,6 mm, hosszúsága 30 cm). A komponenseket 1,6 mm külső átmérőjű, 0,23 mm belső 15 átmérőjű rozsdamentes acélcsövekkel kötjük össze. Eluálószerként 55 rész 0,1 mólos ammónium-acetát oldat és 45 rész tetrahidrofurán elegyét alkalmazzuk, amelyet 2 ml/perc áramlási sebességgel szivattyúzzuk a rendszerbe. 20 A nyers A kivonat előállítása 35 liter nyers fermentlevet, amelynek pH-értéke 7,2 (előállítását a 4. példában leírt általános eljárással végezzük) egyenlő térfogatú (35 liter) etil-acetáttal keve- 25 rünk össze egy polipropilénből készült tartályban, és levegővel hajtott keverő alkalmazásával 2 órán át kever11
