202590. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonin előállítására
3 HU 202 590 B 4 cisztint vagy analógjaikat tartalmazó minimál agar-lemez táptalajon végezzük. Az L-treonin úgy állítható elő, hogy a fenti mutánsokat szénforrásokat, nitrogénforrásokat, szervetlen sókat, növekedési faktorokat és hasonlókat tartalmazó szintetikus vagy természetes táptalajban tenyésztjük, amíg L-treonin halmozódik fel a fermentlében, és utána ebből kinyerjük az L-treonint. Szénforrásokként szénhidrátok, például glükóz, fruktóz, melaszok, keményítő hidrolizátum és nyerscukor-hidrolizátum, valamint szerves savak, például ecetsav, propionsav, hangyasav, fumársav és almasav használhatók. Nitrogénforrásokként ammónia, szervetlen és szerves savak ammóniumsói, például ammónium-klorid, ammónium-szulfát, ammónium-acetát és ammónium-foszfát, aminok és egyéb nitrogéntartalmú vegyületek, pepton, húskivonat, kukoricalekvár, kazein-hidrolizátum, szójadara hidrolizátum, különböző sejttenyészetek és ezek emésztett termékei stb. használhatók. Szervetlen vegyülctekként kálium-hidrogén-foszfát, dikálium-hidrogén-foszfát, magnézium-foszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas(II)-szulfát, mangán-szulfát, réz(II)-szulfát, kalcium-karbonát stb. használhatók megfelelő mennyiségben. Amennyiben a felhasznált törzs tápanyagokat is igényel, úgy a növekedéshez szükséges vegyületeket is kell adni a táptalajhoz. Bizonyos esetekben elegendő mennyiségű ilyen tápanyagokat biztosíthat más táptalajkomponens is, és így nincs szükség külön pótlásra. A tenyésztést aerob körülmények között végezzük, például rázatott tenyészetben vagy merített tenyészetben levegőztetés és keverés közben 20 'C-tól 40 “C-ig, előnyösen 28 “C-tól 38 "C-ig teijedő hőmérséklettartományban. A táptalaj pH-ját a tenyésztés során 5 és 9 között tartjuk, előnyösen semleges körüli pH-n. A pH-t kalcium-karbonát, szervetlen vagy szerves savak, lúgos oldatok, ammónia, pufferoldatok vagy hasonlók segítségével állítjuk be. Az L-treonin általában 2-7 napig tartó tenyésztés alatt halmozódik fel a fermentlében. A tenyésztés befejeztével a kiválásokat, például sejteket szűréssel, centrifugálással stb. eltávolítjuk a tenyészetből, és az L-treonint a kapott fermentléből ioncserés kezelés, bcpárlás, kisózás stb. kombinációjával nyerjük ki. A találmány speciális megvalósítását a következő mintapéldákkal szemléltetjük. 1. példa Oltó törzsként Escherichia coli H-7256, Escherichia coli H-7263, Escherichia coli H-7293, Escherichia coli H-7294 és Escherichia coli H-4258 törzseket használunk. Az egyes törzseket 20 g/liter glükózt, 10 g/liter peptont, 10 g/liter élesztőkivonatot, 2,5 g/liter nátrium-kloridot és 0,1 g/liter diamino-pimelinsavat tartalmazó oltó-táp talajban tenyésztjük 30 *C-on 16 óra hosszat rázatva. Utána 2 ml így kapott oltótenyészetet inokulálunk egy 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban lévő 20 ml alább megadott összetételű fermentációs táptalajba, és 30 'C-on 72 órát rázatva tenyésztjük. A fermentációs táptalaj összetétele: 70 g/liter glükóz, 14 g/liter ammónium-szulfát, 2 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát, 1 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrat, 0,3 g/liter diamino-pimelinsav, 0,1 g/liter DL-metionin, 2 g/liter kukoricalekvár és 30 g/liter kalcium-karbonát (pH = 7,4). A tenyészetben keletkező L-treonin mennyiségét a 2. táblázatban láthatjuk. 2. táblázat Törzs Tulajdonság L-treonin mennyisége (g/liter) H-7256 Cisztin-hidroxamát-rezisztencia 22,3 H-7263 Allil-glicin-rezisztencia 21,2 H-7293 Cisztein-rezisztencia 20,1 H-7294 Cisztin-rezisztencia 19,8 H-4258 17,2 A H-7256 törzs alkalmazásával kapott 200 ml L-treonin-tartalmú fermentlevet 10 percig percenkénti 3000 fordulattal centrifugáljuk a sejtek és egyéb szennyezések eltávolítása céljából. A kapott felülúszót az erősen savas Diaion SKI kationcserélő gyantával (hidrogénciklus, a Mitsubishi Kaséi Corporation terméke) töltött oszlopon átengedve felkötjük az L-treonint. Az oszlopot vízzel végzett mosás után 0,5 n vizes ammónium-hidroxid oldattal eluáljuk. Az L-treonint tartalmazó frakciókat összegyűjtjük és bepároljuk, majd etanolt adunk a koncentrátumhoz. Az elegyet lehűtve állni hagyjuk. így 2,5 g kristályos L-treonint kapunk, amely 98%-os vagy nagyobb tisztaságú. 2. példa A H-7256, H-7263, H-7293, H-7294 és H-4258 törzsekből az 1. példában leírthoz hasonló módon oltótenyészetet készítünk. A kapott oltótenyészetből 100 ml-t inokulálunk egy 2 literes fermentorban lévő 1 liter alább leírt összetételű fermentációs táptalajba. A tenyésztést 30 *C-on keveréssel és levegőztetéssel (700 fordulat/perc; 1 litcr/pcrc) 80 (ka hosszat folytatjuk, mialatt a fermentációs táptalajba pótlásként megfelelő mennyiségű 60%-os glükóz oldatot adunk, és a táptalaj pH-ját vizes ammónium-hidroxid oldattal 6,5 körül tartjuk. A fermentációs táptalaj összetétele: 30 g/liter glükóz, 12 g/liter ammónium-szulfát, 3 g/liter kálium-dihidrogén-foszfát, 0,2 g/liter magnézium-szulfát-heptahidrát, 6 g/liter diamino-pimelinsav, 1 g/liter DL-metionin és 12 g/liter kukoricalekvár. A tenyészetben keletkező L-treonin mennyiségét a 3. táblázatban láthatjuk. 3. táblázat Törzs L-treonin mennyisége (g/liter) H-7256 63,5 H-7263 62,1 H-7293 55,8 Ht7294 56,0 H-4258 49,6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
