202588. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fehérje-fémion biokomplexek előállítására radiolízissel
3 HU 202 588 B 4 minták készítéséhez a besugárzott mintákat 6000 fordulaton 20 percig centrifugáltuk, majd a folyadékot liofilizálluk 1,3.10"* kPa nyomáson, 0 *C-on. Az így kapott por alakú anyag jó vízoldékonyságú és atomabszorpciós spektrométeres méréshez jól felhasználható volt. 5 A komplex és szabad-ionok meghatározására olyan mérési módszert dolgoztunk ki, amely lehetőséget biztosít fehérjementes, vizes oldatokban lévő összes fémionkoncentráció meghatározására. Kiegészítve a meghatározási módszert Dowex 50 V-8 ioncserélő oszlop- 10 kromatográfiás elválasztási módszerrel lehetőség adódik a komplex kötésben lévő ionok meghatározására is. A kettő különbségéből a szabad ion összetétel, az első mérésből az össz. fémkoncentráció meghatározható. Az adott módszert Zn, Mg, Fe, Cu meghatározására 15 alkalmazzuk. A meghatározáshoz Perkin-Elmar 306 típusú két sugaras atomabszorpciós spektrométert használunk. Mérési módszer szükséges a protein porok fémkoncentráció-tartalmának meghatározására is, amelyek ere- 20 detileg Li, Na, K, Mg-ionokat tartalmaznak. Vizes oldatban történt mérések esetén a koncentrációkat mikrogram/ml, vagy mg/1 értékben aduik meg. Szilárd minták esetén a koncentrációkat mikrogram/g értékben határoztuk meg. Meghatároztuk a vizes oldatok oldott fehérje- 25 koncentrációját is, melyhez a Lowry-féle fehérje meghatározási módszert alkalmaztuk. Az így kialakított méréstechnika segítségével lehetőség nyűt vizes oldatban különböző fehérjekoncentrációt és a különböző koncentrációkban jelenlévő fémionok 30 kölcsönhatásának vizsgálatára a besugárzási dózis függvényében. A vizsgálatok előtt meghatároztuk a fehérjekészítmények eredeti Zn-, Fe-, Mg- és Cu-tartalmát. Vizsgáltuk a fehérjetartalmú oldat fémkoncentrációjának változá- 35 sát 6-60 Mrad besugárzási tartományban és azt tapasztaltuk, hogy a proteinhez komplexen kötődő különböző vizsgált fémionok mennyiségei változnak. Kb. 20 Mradnál jelentkezik egy telítési szakasz, utána csak kismértékű növekedés mutatkozik a sugárdózis további nőve- 40 lésénél, ezért a biokomplexek előállításához a 20 Mrad értéket választottuk. A sorozatos mérések során megállapítható volt, hogy minden esetben reprodukálható ionbeépülés történt komplexképződés közben. Külön vizsgáltuk az eredeti protein porok és a liofili- 45 zált 20 Mrad sugárdózissal módosított fehérjeporok összetételét a molekuláris összetétel meghatározása és összehasonlítása céljából. Megállapítottuk, hogy az eredeti fehérjékhez viszonyítva, amelyben a 150 000 móltömeget meghaladó protein mellett a 120 000 móltöme- 50 gű fehérje található nagyobb koncentrációban és csak kevés a 30 000, illetve 10 000 móltömeg körüli koncentráció, addig a 20 Mrad-dal besugárzott minták esetében szintén megtalálható a 150 000-nél nagyobb móltömegű fehérjefrakció, a móltömeg fokozatos csökkenése mel- 55 lett 60 000 móltömeg környékén jelentkezik egy fehérjecsúcs és szignifikánsan megnövekszik a 10 000 móltömegű fehérjefrakció mennyisége. Feltehetően a komplexképzőképesség megnövekedése ezen 10 000 móltömeg körüli fehérje fragmentum növekedésével 60 hozható összefüggésbe. A radiációs folyamatoknak a szövetekben előforduló ionkoncentrációkhoz hasonló oldat összetétellel történő koordinálása különleges hatékonyságot biztosít Feltételezéseink igazolására biológiai kísérleteket végeztünk. A kísérletekben egy „bio- 65 komplex” 2,5 t%-os vizes-alkoholos oldatát készítettük el, melyet patkányok bőrébe bedörzsölve hatását vizsgáltuk. Kísérleteink igazolták, hogy a különböző szöveti szintekben, valamint a patkányt* szőrzetében emelkedett a biokomplexbe beépített fémek koncentrációja. Mivel mind a szöveteknél, mind a szőrben a kezeleüen oldalon is mutatkozott a kezelt oldalhoz hasonló jellegű, de annál abszolút számban mérsékeltebb koncentrációnövekedés, megállapítható volt, hogy a biokomplex makro- vagy mikrocirkuláció révén általános hatást is kifejthet Kísérletein során bizonyítottuk azt is, hogy az eljárás segítségével olyan biokomplexek állíthatók elő, amelyek széles körben alkalmazhatók különböző élettani folyamatok befolyásolására, így a kozmetikában, növényvédelem, ill. növényápolásban stb. 1. példa 5 t% állati proteint, vagyis vérplazmát oldottunk olyan desztillált vízben, amely 0,5 mg/1 Cu-t, 0,35 mg/1 Fe-t, 2500 mg/1 Zn-t, 500 mg/1 Mg-t tartalmazott ekléndiamin-tetraecetsavas (EDTA) komplex alakjában. Az oldat pH-ját citrát pufferrel 4,7-re állítottuk be. Az oldatot 1 literes üvegedényben 25 *C-on “Co sugárforrás alkalmazásával, kémiai dozimotrálás mellett közvetlenül besugároztuk 20 Mrad (200 k Gray) sugárdózissal 24 órán keresztül. Besugárzás után a polimerizálódott nem vízoldékony fehérjét centrifugálással elkülönítettük. A polimerált rész 7,0 g volt a bevitt protein 16,2 t%-a. A folyadékfázist 1,3* lfr4 kPa-n 0 ‘C-on liofilizáltuk. A liofilizáll termék 43 g, nyeredék 83,8 t%. Az eredeti proteint az elkészített, valamint a besugárzás után kapott oldatot és a liofilizált terméket a leíró részben leírtak szerint vizsgáltuk. Móltömeg megoszlás besugárzás előtt 150 000 70% 120 000 15% 50 000 8% 10000 7% Móltömeg megoszlás besugárzás után 150 000 55% 60 000 3% 26 000 16% 10000 26% Komplex formában kötött fém a protein porban: Besugárzás előtt Besugárzás után Beépülés% Mg 0 1,56 mg/g 3,6% Cu 0 0,05 mg/g 100,0% Zn0 17,7 mg/g 41,2% Fe 0 5,01 mg/g 100,0% 2. példa 51% növényi proteint, vagyis szójafehérjét oldottunk olyan desztillált vízben, amely 0,5 mg/1 Cu-t, 0,35 mg/1 Fe-t, 2550 mg/1 Zn-t, 500 mg/1 Mg-t tartalmazott etiléndiamin tetraecetsavas komplex (EDTA) alakjában. Mg** helyett felhasználhatunk Al*** iont is So4-os acetátos, cifrátos vagy tartarátos só alakjában. Az oldat pH-ját citrátpufferrel 4,7-re állítottuk be. Az oldatot 1 literes üvegedényben 25 ‘C-on “Co sugárforrás alkalmazásával, kémiai dozimotriálás mellett közvetlenül besugá-3
