202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
15 HU 202 587 B 16 nukleinsav ligáz pufféiban oldjuk, a pufferhoz előzőleg 20 pmól foszforilezctt BamHI linkért (5’- - CCGGATCCGG-3’; Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk. 4 *C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk az elegyet, majd a ligáz inaktiválására 10 percen át 65 “C hőmérsékleten tartjuk, ezt követően pedig az alábbi összetételű BamHI puffernd 100 pl-re egészítjük ki: 150 mmól/1 nátrium-klorid, 20 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 8,0, 10 mmól/1 magnézium-diklorid, és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. Ez az elegy 20 egység BamHI enzimet is tartalmaz. 2 órán át 37 ‘C hőmérsékleten tartjuk a reakcióelegyet, majd 1% agarózt tartalmazó gélen tisztítjuk. A gélt festjük és a 4,5 kb nagyságú nagyobb fragmenst eluálással elkülönítjük, miután fagyasztottuk. Ezután fenol és kloroform elegyével extrahálva és etanollal kicsapva tisztítjuk a terméket A kohézív BamHI végekkel rendelkező tisztított fragmenst 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldjuk, ez 0,1 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. 16 órán át 4 °C hőmérsékleten ligálunk, majd a kapott dczoxi-ribonukleinsavval E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin (Ap1) rezisztencia alapján szelektáljuk, 100 pg/ml ampicillin jelenlétében. A telepeket 10 pg/ml tetraciklinnel szembeni érzékenységre vizsgáljuk (Te’). Több ApTc’ gcnoiípusú és az előzőekben megadott Bimboim-módszerrel izolált plazmidot vizsgálunk a Hindin hely hiányára és az egyetlen BamHI hely jelenlétére. EcoRI és Sail restrikciós endonukleázokkal egymást követő emésztés után 466 és 305 bázispárból álló fragmenseket kapunk. Egy ilyen plazmidot (2. ábra: 104) szelektálunk, és ezután az Ipp promotertől 5’-irányban elhelyezkedő EcoRI helyet Hindin hellyé alakítjuk át. 2 pg plazmid (2. ábra: 104) dczoxi-ribonukleinsavat 100 pl EcoRI pufféiban 0,2 egység EcoRI restrikciós endonukleázzal kezelünk 10 percen át 37 ’C hőmérsékleten. A reakció leállítására 10 percen át 37 °C hőmérsékleten. A reakció leállítására 10 percen át 65 *C hőmérsékleten tartjuk az oldatot, majd ezután fenol és kloroform elegyével extrahálunk, és a dezoxi-ribonukleinsavat etanollal kicsapjuk. A terméket 200 pl Sí nukleáz pufferben oldjuk, a puffer 1000 egység/ml S1 nukleázt tartalmaz. A reakciót 1 órán át végezzük 12 °C hőmérsékleten. A reakció leállítását fenol és kloroform elegyével kivitelezett extrakcióval végezzük, a terméket etanollal csapjuk ki. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 pl, 20 pmól foszforilezett HindlII linkért (5’-CCAAGCTTGG-3’; Collaborative Research) és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban szuszpendáljuk. 16 órán át 4 ‘C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd 10 percen át 65 *C hőmérsékleten tartjuk, és 150 pl, 10 egység Hindin enzimet tartalmazó Hindin pufferral hígítjuk 150 pl végtérfogatig. Az elegyet 2 órán át 37 'C hőmérsékleten inkubáljuk, majd ezután 1% agarózt tartalmazó gélen frakcionáljuk. A legnagyobb csíkot (az egyetlen vágást szenvedett plazmiddal azonos) ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk, majd 20 pl, 0,2 egység T4 ligázt tartalmazó T4 ligáz pufferban oldjuk. A reakcióelegyet 4 *C hőmérsékleten 16 órán át inkubáljuk, majd E. coli HB101 sejteket transzformálunk. A transzformánsokat ampicillin rezisztenciára szelektáljuk, és az ismert módon izolált plazmidokat restrikciós enzimes analízisnek vetjük alá. Szelektáljuk az EcoRI-HindM fragmenst tartalmazó plazmidot (2. ábra: 105), és klónozó vektorként használjuk fel az lpp gén 3’-iégiójának klónozására. 2 pg plazmid (3. ábra: 105) dezoxi-ribonukleinsavat 50 pl Sail restrikciós pufferban 2 egység Sáli enzimmel kezelünk. A puffer összetétele a következő: 150 mmól/1 nátrium-klorid, 6 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,9, 6 mmól/1 magnézium-diklorid, 6 mmól/1 ß-meikapto-etanol. A reakciót 1 órán át 37 ‘C hőmérsékleten végezzük, majd 2 egység BamHI enzimet tartalmazó BamHI pufferral 150 pl végtérfogatra hígítjuk. 1 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk a reakcióelegyet, majd 2,5 egység alkalikus foszfatázt adagolunk, és 1 órán át 65 *C hőmérsékleten folytatjuk az inkubálást A terméket fenol és kloroform elegyével extraháljuk, etanollal kicsapjuk, TEN (lásd előbb) elegyben oldjuk, és felhasználjuk az lpp gén 3’-fragmensének klónozására. Az lpp gén 3’-régióját tartalmazó fragmens előállítására 10 pg pKENl 11 (3. ábra: 101) dezoxi-ribonukleinsavat 200 pl, 10 egység Hpal enzimet tartalmazó alábbi összetételű Hpal pufferban oldunk: 20 mmól/1 kálium-klorid, 10 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, 10 mmól/1 magnézium-diklorid és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. A reakciót 2 órán át 37 "C hőmérsékleten végezzük. A dezoxi-ribonukleinsavat fenol és kloroform elegyével extraháljuk és etanollal kicsapjuk, a kicsapott terméket 10 pl, 20 pmól foszforilezett Sail linkért tartalmazó T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufféiban oldjuk, az oldathoz 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt adunk. A linker az alábbi nukleotid sorrendű: 5’-GGTCGACC-3’, beszerezhető: Collaborative Research. A reakciót 16 órán át végezzük 4 *C hőmérsékleten. A ligáz inaktiválására 10 percen át 65 °C hőmérsékleten tartjuk az elegyet. A kapott elegyet 10 egység Sáli enzimet tartalmazó Sail pufferral 100 pl-re hígítjuk és 1 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezután 300 pl térfogatúra hígítjuk 10 egység PvuII restrikciós enzimet tartalmazó, alábbi összetételű PvuII pufferral: 60 mmól/1 nátrium-klorid, 6 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,5, 6 mmól/1 magnézium-diklorid, 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. 1 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsavat 5% poli-akril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk. 0,5 pg, 950 bázispárból álló fragmenst különítünk el, tisztítunk és oldunk TEN elegyben. 0,2 pg fragmenst 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban oldunk, ez 20 pmól foszforilezett BamHI linkért (5’-CCGGATCCGG-3’; Collaborative Research), és 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligázt tartalmaz. Az elegyet 16 órán át 4 *C hőmérsékleten inkubáljuk. A kapott dezoxi-ribonukleinsavat 10 percen át 65 "C hőmérsékleten tartjuk, és ezután 100 pl BamHI pufferral hígítjuk, a puffer 20 egység BamHI enzimet tartalmaz. 2 órán át 37 *C hőmérsékleten inkubáljuk az elegyet, és ezután 5% poliakril-amidot tartalmazó gélen frakcionáljuk a fölös linker molekulák eltávolítására. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
