202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
25 HU 202 587 B 26 nátrium-klorid 0,5%, agar 1,5%, pH = 7,4. A táptalaj ml-enként 50 pg kanamicint tartalmaz. Az E. coli K12 RV308 törzset az alábbi állandó törzsgyűjteménybe helyeztük letétbe NRRL B-15624 sorszámon: Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois. A kapott transzformánsok közül néhány, ahogy azt az ismert módon kivitelezett agaróz gél-elektroforetikus analízis [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] jelzi, csak a 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazza. Egy ilyen transzformánst szelektáltunk, E. coli K12 RV308/pCZ101 jellel jelöltünk, ampicillint tartalmazó TY agaron szélesztettük, majd ismert bikorbiológiai technikákat használva tenyésztettük. A kapott sejteket hazsnáljuk fel az L példa A) pontja szerint eljárva a pCZIOl plazmid izolálására. 3. példa A pCZ114 plazmid és az E. coli K12 RV308lpCZ114 törzs előállítása A) A pCZIOl plazmid 10,2 kb nagyságú Bamlll-Xbal fragmensének előállítása A fragmenst a 2. példa B) pontja szerint eljárva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pNM789 plazmid helyett a pCZIOl plazmidot használjuk. Az előállítandó 10,2 kb nagyságú BamHI-Xbal restrikciós fragmenseket agaróz gél-elektroforézissel ismert módon izoláljuk [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb], és ezután 100 pl TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 °C hőmérsékleten tároljuk. B) A pCZIOl plazmid 0,6 kb nagyságú Bamlil-llgiAl fragmensének előállítása A fragmenst a 2. példa B) pontja szerint eljárva állítjuk elő, azzal a különbséggel, hogy a pNM789B plazmid és az Xbal restrikciós enzim helyett a pCZIOl plazmidot és a HgiAI restrikciós endonukleázt használjuk. A0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI restrikciós fragmenseket ismert módon agaróz-gél-elektroforézissel izáljuk [Maniatis és munkatársai (1982), lásd előbb] és ezután 100 pl TE-pufferban oldjuk, és felhasználásig 0 'C hőmérsékleten tároljuk. C) A dezoxi-ribonukleinsav linker szekvencia előállítása Az alábbi nukleotid-sorrendű linker szekvenciái állítjuk elő: 5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTG GAG GAT GAT TAA ATG TTC CCA GCC 3’-----------TCCCATAATTAT TAC AAC CTC CT A CT A ATT TAC AAG GGT CGG ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’ TAC AGG AAC AGG CCC GAC AAA CGG TTG CGAC-----------5’. Az adott linker szekvenciát módosított foszfo-triészter módszerrel állítjuk elő, lényegében az alábbi közlésekben leírtak szerint eljárva: Itakura és munkatársai, 1977, Crea és munkatársai, 1978; lásd előbb. A szintézis módszerét az 1. példában is részletesen szemléltetjük. D) Ligálás és transzformálás A 3. példa C) pontja szerint előállított dezoxi-ribonukleinsav linker 20 pmólnyi mennyiségét, 1 pg, a pCZIOl plazmidból származó 10,2 kb nagyságú Bam- HI-XbaI fragmenst és 0,5 pg, a pCZIOl plazmidból kapott 0,6 kb nagyságú BamHI-HgiAI fragmenst keverjük és ligálunk. A kapott plazmiddal E. coli K12 RV308 sejteket transzformálunk a 2. példa D) pontja szerint eljárva. A kapott transzformánsok közül néhány az ismert módon végzett agaróz gél-elektroforetikus analízis [Maniatis és munkatársai (1982)] és más vizsgálatok szerint csak az adott 10,8 kb nagyságú plazmidot tartalmazzák. Ezeket a transzformánsokat E. coli K12 RV308/pCZl 14 jellel jelöljük, szelektáljuk őket, ampicillint tartalmazó TY-agaron szélesztjük, és ismert mikrobiológiai technikákat használva tenyésztjük. A kapott sejtek a nátrium-lauril-szulfát gél-elektroforézis, RIA és más vizsgálatok szerint kifejezik a met-bGH-t, mégpedig nagy mennyiségben. Mivel a pCZ114 dezoxi-ribonukleinsav tcrmindukálható, ún. runaway (elveszthető) replikont tartalmaz, az adott met-bGH kifejeződése maximálisan bekövetkezik 37 °C hőmérsékleten. 4. példa A pCZIOl.1 plazmidésazE. coliK12RV308lpCZ101.1 törzs előállítása A kísérleteket a 3. példában megadottak szerint végezzük, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C) pontjában megadott linker szekvencia helyett az alábbi nukleotid-szckvenciájú fragmenst használjuk: 5’-CTAGAGGGTATTAATA ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT TAA ATG TTC 3’----------TCCCATAATTAT TAC AAG GGT AAC CTA CTA CTA ATT TAC AAG CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT-3’ GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C----------5’. A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) módszere szerint állítjuk elő. A szintézis módját az 1. példában részletesen szemléltetjük. Az E. coli K12 RV308/pCZ101.1 jellel jelzett transzformánsokat anepicillint tartalmazó TY agaron szélesztjük,és ezután felhasználjukapCZIOl.l plazmid termelésére és izolálására, ismert módon kivitelezett tenyésztést követően. A nátrium-lauril-szulfálos gél-elektioforézis, RIA és más vizsgálatok szerint a transzformánsok nagy mennyiségben kifejezik a metionin-szarvasmarha növekedési hormont. Mivel a pCZIOl .1 plazmid hőindukálható, ún. runaway replikont tartalmaz, a met-bGH maximális kifejeződése következik be 37 °C hőmérsékleten. 5. példa a pH 17A4A1 plazmid előállítása A mellékelt 15. ábrán adjuk meg a pH17A4Al plazmid előállításának vázlatát A) A pBRlltrp plazmid előállítása A pGMl plazmid hordozza az E. coli triptofán operonját egy ALE1413 jelű delécióval [Miozzari és munkatársai, J. Bacteriology, 1457-1466 (1978)], és ezért olyan fúziós proteint fejez ki, amely a trp vezető proteinjének első 6 aminosavát és a trpE polipeptid (a továbbiakban LE’ jellel jelöljük) utolsó harmadát, to5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
