202587. lajstromszámú szabadalom • Eljárás rekombináns DNS vektorok előállítására és génkifejezésre
21 HU 202 587 B 22 mensének előállítására 10 pg plazmidot 10 egység PvuII enzimmel emésztünk 1 órán át 37 *C hőmérsékleten 200 pl PvuII pufferral készült elegy ben. A fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen különítjük el, és a 494 bázispárból álló fragmenst (6. ábra: 112) ismert módon azonosítjuk és tisztítjuk. Köztes plazmidot állítunk elő (6. ábra: 114) úgy, hogy 0. 2.pg pNM702 plazmidból származó PvuII fragmenst kapcsolunk 0,05 pg 494 bázispárból álló fragmensünkhöz 20 pl T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz pufferban, 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenlétében. A reakciót 16 órán át végezzük 4 'C hőmérsékleten. A transzformánsok előállítására transzformációt és ampicillin jelenlétében szelekciót végzünk, majd a transzformánsokból a plazmidot izoláljuk és analizáljuk a 494 bázispárból álló PvuII fragmens jelenlétére és megfelelő orientációjára. A további kísérletekhez kiválasztjuk a 494 bázispárt tartalmazó PvuII fragmenst és a 440 bázispárból álló Xbal-Smal fragmenst tartalmazó plazmidokaL 10 pg köztes plazmidot (7. ábra: 114) egy egység PvuII enzimmel emésztünk 200 pl PvuII pufferral készült reakcióelegyben 5 percen át 37 °C hőmérsékleten, 10 percen át 65 *C hőmérsékleten tartjuk az clcgyet, majd 1% agaróz gélen elektroforézist végezve elkülönítjük és tisztítjuk az egyetlen PvuII helyet tartalmazó lineáris dezoxi-ribonukleinsavat. A kapott 3 pg-nyi terméket 5 egység Xbal enzimmel teljesen emésztjük, és alkalikus foszfatázzal kezeljük. A fragmenseket 1% agaróz gélen tisztítjuk és a legnagyobb fragmenst (az Xbal és az első PvuII hely között a humán és szarvasmarha növekedési hormonban lévő 109/bázispárt már nem tartalmaz) ismert módon izoláljuk (7. ábra: 115). A szarvasmarha növekedési hormon első 23 aminosavát (69 bázispár) leíró dezoxi-ribonukleinsav szekvencia az első PvuII restrikciós helyig két Hpall restrikciós helyet tartalmaz, az első a kódoló szekvencia első nukleotidjától 23 bázispámyi távolságra helyezkedik. 63 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 116) szintetizálunk foszfo-triészter módszerrel. Ez a szakasz a következő részeket tartalmazza: az lpp riboszóma kötőhelyen lévő Xbal helytől számítva 19 bázispámyi szekvencia, az ATG transzlációs start jel, majd 24 bázispámyi rész, amely az alábbi pepiidet határozza meg: Phe-Pro-Leu-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys:, tartalmaz továbbá 20 nukleotidot, amely a szarvasmarha növekedési hormont kódoló szekvencia egy része (a Phe-től az első Hpall helyig). A fragmens az alábbi szekvenciájú: Xbal 5’-CT AG AGGGT ATTA AT A ATGTTCCC ATTGGATGATGATGATAAG-3>-----------TCCCATAATTATTACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCTTCCCAGCCATGTCCTTGTC----------3’ Hpall AAGGGTCGGT AC AGG AAC AGGC-----5’ A 60 bázispárból álló fragmens előállítására a következő szegmenseket izoláljuk: 1. CTAGAGGGTAT 2. TAATAATGTTCC 3. CATTGGATGAT 4. GATGATAAGTTCC 5. CAGCCATGTCCTTGTC 6. ATGGG AAC ATT ATTA AT ACCCT 7. TTATCATCATCATCCA 8. ATGGCTGGGAAC 9. CGGACAAGGAC. A fenti szegmenseket és T4 ligáz enzimet használva lépésenként állítjuk elő a 66 bázispárból álló fragmenst, az alábbiak szerint: a) az 5’-nem foszforilezett 1 szegmenst hozzákapcsoljuk az 5’-foszforilezett 2 szegmenshez 5’-foszforilezett 6 szegmens jelenlétében T4 ligáz enzimmel, amikor megkapjuk az 1 duplexek Ezt 15% poliakrilamidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítjuk. b) Az 5%-foszforilezett 3, 4 és 5 szegmenseket 5’-foszforilezett 7, 8 és 5’-nem foszforilezett 9 szegmens jelenlétében T4 ligázzal kapcsoljuk, amikor megkapjuk a 2 dezoxi-ribonukleinsav duplexet. Ezt 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tiszu'tjuk. c) Az 1 és 2 dezoxi-ribonukleinsav duplexeket ezután T4 ligázzal összekapcsoljuk, amikor megkapjuk a 7. ábrán 116 számmal jelzett dezoxi-ribonukleinsav duplexet, amit 15% poliakril-amidot tartalmazó gélen elektroforézissel tisztítunk. Ezt a dezoxi-ribonukleinsav duplexet ezután ismert módon enzimatikusan foszforilezzük T4 polinukleotid kináz enzimmel (gamma-P32)-ATP jelenlétében. A 46 bázispárból álló dezoxi-ribonukleinsav fragmenst, amely reprezentálja a fentiek során leírt Hpall hely és a PvuII hely közötti szakaszt, előállíthatjuk szintetikusan, de izolálhatjuk az eredeti pBR348 plazmidból is. így, 100 |ig pBR348 plazmid dezoxi-ribonukleinsavat 50 egység PvuII enzimmel emésztünk 400 pl PvuII pufferban, 2 órán át 37 ’C hőmérsékleten. Fenolos extrakció és ctanolos kicsapást követően a kapott dezoxi-ribonukleinsavat 400 pl alábbi összetételű PstI pufferban oldjuk: 50 mmól nátrium-klorid, 6 mmól trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, 6 mmól magnézium-diklorid, és 6 mmól ß-merkapto-etanol. Az elegyhez 50 egység PstI enzimet adunk, és 2 órán át 37 °C hőmérsékleten inkubálunk. A dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 6% poliakril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk, és a 46 bázispárból álló szekvenciát tartalmazó 135 bázispárból álló fragmenst ismert módon elkülönítjük és tisztítjuk. Az elkülönített dezoxi-ribonukleinsav 1/3 részét (megfelel 33 pg-nak) egy egység Hpall restrikciós enzimmel részlegesen emésztjük 100 pl alábbi összetételű Hpall pufferban: 20 mmól/1 trisz-hidro-klorid, pH = 7,4, 7 mmól/1 magnézium-diklorid, és 6 mmól/1 ß-merkapto-etanol. A reakciót 40 percen át 37 "C hőmérsékleten végezzük. 10 percen át 65 'C hőmérsékleten tartjuk az elegyet, majd a dezoxi-ribonukleinsav fragmenseket 5% akril-amidot tartalmazó gélen futtatjuk (akril-amid: bisz aránya = 19:1), a futtatáskor megfelelő marker fragmenseket is használunk. A 135 bázispárból álló fragmens Hpall részleges emésztésével kapott 46 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 112) ismert módon tisztítjuk. 0,2 pg plazmid vektor (7. ábra: 115) Xbal-PvuII fragmenst, 3,2 pmól szintetikusan előállított, 63 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 116) és 0,5 pmól 46 bázispárból álló fragmenst (7. ábra: 112) inkubálunk 10 pl ligációs pufferban 2 egység T4 dezoxi-ribonukleinsav ligáz jelenétében 16 órán át 4 ’C hőmérsékleten. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
