202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
7 HU 202 586 B 8 val eltávolítjuk vagy helyettesítjük (arginin és/vagy lizin), vagy olyan maradékokat inszertáltunk, amelyek a bázis maradékokat lényegében képtelenné teszik a proteolitikus hasadásban való részvételre. Az előnyös mutációkat az alábbi táblázatban adjuk meg. A táblázat adatait azonban csak szemlélte tőnek szánjuk, semmiképpen nem a felhasználható mutációk kimerítő felsorolásának. Urokináz maradékok Mutációs történés (v = vagy) l.Lys133 2- Lysij« 3. ArguéPhe^LySisg 4. PheIS7Lys138 5. LyslJg 6. LysRijgIle1}9 A; v. LySi35—»His, Ser v. Tyr A; v. Lys13<r->Pro His His A; v. Arg1S6Phe157Lys158-> Ser Phe157 Ser Tyr Tyr Glu Glu V. V. Gly 156 Gly His, A; v. Phe157Lys158—> Phe. 1S7 Ser, Tyr, Gly, V. Gly 158 A; v. Lys158-»His, Ser, Tyr v. Gly->Lys1S8ProIle159 158 Ha Lysnj változatlan vagy argininné mutált, a Lys^t prolinná kell mutálni vagy delécióval el kell távolítani. Ha viszont a Lys1J8 változatlan vagy arginné 30 mutált, prolint kell inszeitálni a Lysisg és az Ile159 helyek közé vagy az Ile^-et prolinnal kell helyettesíteni. A legelőnyösebb változatok a deléciós mutánsok, különösen a Lys13S, Arg156 és LysIS8 melyeket szorosan követ a felsorolt három maradék hiszüdil szubsztitúciója, 35 mert az ilyen mutánsok ellen legalábbis nagy valószínűséggel ellenanyagok termelődnek a betegek szervezetében. Legelőnyösebb a Lys135 vagy LysI36 és a Phe157LySiÄ egyidejű eltávolítása. Az így kapott mutáns előnye, hogy bár az Argl56 után korlátozott protcolízis 40 fellép, amikor végbemegy a kettős szálú formához vezető proteolitikus átalakulás, a kapott molekula mindkét urokináz láncban ugyanazokkal a C és N terminusokkal rendelkezik, mint a kettős szálú urokináz (a prourokináz normál proteolízise in vivo felszabadítja a Phe 45 Lys dipeptidet). Ezen felül, ennél az előnyös mutánsnál * a molekula HŰK formában marad. A proteáz-rezisztens variánst kódoló nukleinsavat beépítjük egy expressziós vektorba, a vektorral gazdasejtet transzformálunk, a transzformánst addig te- 50 nyésztjük, amíg a kívánt urokináz variáns felgyűlik a tenyészetben, miután a variánst elkülönítjük a tenyészetből. A rekombináns urokináz előállítása az irodalomból ismert módszerekkel történik (92 182 sz. európai szabadalmi bejelentés). Ezek mindegyike alkalmas 55 a kívánt variánsok létrehozására. A példákban ismertetett eljárás csak szemléltetésül szolgál, természetesen egyéb vektorok és gazdasejtek is kielégítő eredménnyel alkalmazhatók a kívánt variánsok előállítása során. Állati szövettenyészet sejtjeinek gazdasejtként való 60 alkalmazását urokináz előállítására a 92 182 sz. EP szabadalmi bejelentés részletesen leírja. Ennek alapján a módosított fehérje kifejezése állati sejtekben ezzel teljesen analóg módon végrehajtható. A rekombináns baktériumokban közvetlenül termelt 65 urokináz variáns (tehát amelynek a termelése szekréciós irányító nélkül folyik), intracelluláris, vízben oldhatatlan aggregátumok formájában rakódik le, amelyeket refrakciós anyagoknak („refractile bodies”) hívunk. A refrakciós anyagokat elkülönítjük a sejtmasszától, például a sejtfal törmeléktől és egyéb, hasonló anyagoktól. Ezt előnyösen centrifugálással, például szacharóz gradiens szeparálással végezzük. Ezután a refrakciós anyagokat egy protein denaturáló reagensben szolublizáljuk, amely lehet például 6 mólos guanidin-hidroklorid, a reagenst például dialízissel eltávolítjuk, és az urokináz variánst klasszikus technikákkal, például ioncserélő gyantán vagy géloszlopon tisztítjuk. Miután azonban az urokináz variáns proteáz-rezisztens, nincs szükség benzamidin-szefaróz felhasználására az egyes szálú és a kettős szálú urokináz elkülönítésére, és ugyancsak felesleges proteáz inhibitor (1 mól guanidin hidroklorid) vagy a tisztítási lépést követően gyors elkülönítési eljárások alkalmazása. A proteáz-rezisztens urokinázt, akár rekombináns baktériumokban, élesztőkben vagy magasabbrendű eukariota sejtkultúrákban szintetizáltuk, akár a natív urokináz kovalens vagy adszorptív módosításával készült, olyan gyógyszerkészítmények formájában szereljük ki, amelyek alkalmasak a vérrögök feloldására a kezelt betegeknél. A korábban a natív urokinázzal kapcsolatban alkalmazott urokináz koncentrációk, adagolási módok és vivőanyagok egyaránt kielégítőek a találmány szerinti proteáz-rezisztens urokinázok esetében. Általában 10 000-75 000 NE/ml rezisztens urokinázt 5% glükóz vagy más izotoniás intravénás vivőanyaggal formulálunk, egyéb vivőanyagokkal, töltőanyagokkal és kívánt esetben stabilizátorokkal együtt A proteáz-rezisztens urokinázt intravénásán olyan sebességgel adagoljuk, amely elegendő az eldugult artéria vagy véna perfúziójához, szokásos technikákkal végzett megfigyelés szerint Az adagolási sebesség rendszerint nagyobb mint körülbelül 4000 Ne/kg/óra. Általában azon-5
