202586. lajstromszámú szabadalom • Eljárás proteáz-rezisztens urokináz és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmény előállítására
3 HU 202 586 B 4 számára fontos feltételeket is kielégít egy olyan készítmény, amely proteáz-rezisztens egyes láncú urokinázt tartalmaz. A proteáz-rezisztens egyes láncú urokinázt úgy állítjuk elő, hogy az urokinázt egy olyan szerrel kezeljük, amely komplexet alkot az urokinázzal, vagy az egyes láncú urokinázt kovalensen módosítjuk a proteolízis helyein úgy, hogy az urokináz ezeken a helyeken a továbbiakban nem lesz proteolitikusan hidrolizálható. Ezek a helyek felölelik Arg15é és a Lys,» közötti, és előnyösen a Lys135 és a Lys136 közötti helyeket. A kovalens módosításokat úgy hajtjuk végre, hogy a natív urokinázt derivatizáló reagensekkel reagáltatjuk, de alkalmazhatjuk olyan mutánsok rekombináns szintézisét is, amelyek a target helyeken helyspecifikus aminosav szubsztitúciókat, inszerciókat vagy deléciókat tartalmaznak. A komplexképző szerek, így az ellenanyagok a target helyeken vagy azok mellett úgy kapcsolódnak az urokinázhoz, hogy megakadályozzák vagy gátolják a proteáz hozzáférését ezekhez a helyekhez. Az urokináz készítmények úgy készülnek, hogy csökkentsék vagy teljesen kiküszöböljék a proteázok képességét a target helyeken történő hasításra. Ezek a helyspecifikus mutációk megakadályozzák az egyes szálú urokináz kettős szálú urokinázzá alakulását plazminok, bakteriális proteázok, tripszin vagy más proteázok hatására, ezáltal in vivo csökkentik a nem kívánatos mellékreakciók fellépését, anélkül, hogy csökkentenék a mutáns urokináz speciesek képességét arra, hogy egyébként teljes mértékben ugyanúgy viselkedjék, mint a natív egyes szálú urokináz. Kiemeljük, hogy nincs szükség az egyes szálú urokináz in vivo kettős szálú urokinázzá történő átalakítására ahhoz, hogy a plazminogént aktiváljuk. A találmány szerinti mutánsok emberben lényegében nem immunogének, fibrin-specifikusak maradnak és képesek arra, hogy plazminogént anélkül aktiválják, hogy kettős szálú urikonázt juttatnának a szervezetbe. Az 1. ábrán a humán urikonáz aminosav és nukleotid szekvenciáját mutatjuk be. A felső vonal az aminosav szekvenciát, az alatta lévő vonal a nukleotid szekvenciát mutatja. Ugyancsak feltüntettük a nem transziáit 5’ és 3’tartományokat is. Az egyes láncú urikonázt olyan proteinként definiáljuk, amelynek aminosav szekvenciája megegyezik az lAés 1B ábrán bemutatott a humán urikonáz aminosav szekvenciájával nagy molekulatömegű (kb. 54 000 dalion, NH2-Ser! Gln2 Glu3-terminus) vagy kis molekulatömegű (kb. 33 000 dalton, NHrLySné-PromSer^-terminus) speciesében, de a definíció kiterjed azokra az aminosav szekvencia variációkra és származékokra is, beleértve a természetes allélcket, ahol a molekula olyan egyetlen aminosav láncból áll, amely nem hasad az Arg15é-Lys13j proteolitikus hasítási helyeken (a továbbiakban „lánckonverziós helyek”). A proteáz-rezisztens egyes láncú urikonáz olyan urikonáz származék, amely egy aminosav láncból áll, amely kevésbé hajlamos proctolitikus hidrolízisre, mint a megfelelő át nem alakított, természetes formájú urikonáz. Különösen, a proteáz-rezisztens urikonáz nem alakul át kettős láncú urikonázzá a konverziós helyen lejátszódó proteolízis hatására. Ezt tipikusan úgy határozzuk meg, hogy a proteáz-rezisztensnek vélt urikonáz származékot humán plazminnal inkubáljuk, és az így kezelt származék aktivitását egy kromogén szubsztráton, így például S- 2444-en vizsgáljuk a natív egyes láncú, de egyébként azonos módon kezelt és vizsgált urikonáz aktivitásával összehasonlítva. Ha a kiszemelt urikonáz száramzék átalakulása plazmin hatására kettős láncú speciessé (amit a S-2444 hídról itikus aktivitásának megnövekedése jelez) kevesebb mint 50%-a, rendszerint kevesebb mint 10%-a az összehasonlítóként használt natív urikonáz kettős láncú speciessé alakulásának, akkor a kiszemelt származékot proteolízis-rezisztensnek tekintjük. Az eljárást részletesebben a példákban szemléltetjük. A proteolízis-rezisztens egyes szálú urikonázok körébe tartoznak az olyan egyes szálú urikonáz-származékok is, amelyek lényegében képtelenek a proteolitikus hasadásra a 156-158 és 135-136 helyeken (a továbbiakban „LUK” helyen). Ezek olyan származékok, amelyekben a HUK-nak LUK-ká alakulása proteolízisrezisztens urikonázzal kisebb sebességgel megy végbe, mint természetes egyes szálú urikonázzal. Ha a szóban forgó urikonáz származék a tripszin hatására átalakul LUK formába (gélelektroforézissel, gélszűréssel, immunvizsgálattal vagy hasonlókkal meghatározva) kevesebb mint kb. 50%-a, rendszerint kevesebb mint kb. 10%-a az összehasonlítható urikonáz species LUK-ká alakulási sebességének, a szóban forgó urikonáz származékot proteolízis-rezisztensnek nevezzük. A proteolízis rezisztencia definiálható más olyan protázokkal is, melyek jelenléte várható az egyes szálú urikonáz környezetében. Az egyes szálú urikonáz rekombináns szintézisében gazdaszervezetként alkalmazott mikroorganizmusok olyan proteázokat tartalmaznak, így például endo- és exopeptidázokat és bizonyos észterázokat vagy amidázokat, amelyek proteolitikus aktivitással rendelkeznek. E proteázok némelyik hasítja az egyes szálú urikonázt, és különösen nehezen kezelhető a tisztítás során, amik«* a rekombináns urikonáz oldható, és e proteázok megnövekedett koncentrációjának lehet kitéve. Korábban ezt a problémát úgy próbálták megoldani, hogy proteolízis inhibitorokat, például egy mólos guanidin HCl-t alkalmaztak a tisztításhoz használt oldószerekben (92182 sz. európai szabadalmi bejelentés). Ezen felül egy egyes szálú urikonázként azonosított enzimet izoláltak a kétszálas alakba való átalakulás megelőzésére alkalmas, gyors elválasztási módszerekkel (4381 346 sz. USA-beli szabadalmi leírás). A proteáz-rezisztens egyes szálú urikonáz előállítása az irodalomból jól ismert módszerekkel történik. A lánc konverziós helyet, különösen a LUK helyet vagy kovalensen módosítják úgy, hogy kevésbé legyen hajlamos proteolitikus hasadásra, vagy egy olyan reagenssel kombinálják, amely gátolja a proteázoknak az adott helyekre jutását. A proteázok hozzáférését akadályozó reagensek közé tartoznak például a monoklonális antitestek vagy azok fragmentumai, például a fab fragmentumok, amelyek a kérdéses helyekhez vagy szomszédos epitópokhoz kapcsolódnak úgy, hogy az adott helyekhez kötődő ellenanyag szférikusán gátolja a proteázok hozzáférését a helyhez. Ebben az esetben az urikonáz lehet akár natív, akár mutáns, de mindenképpen nem kovalensen kötődik egy olyan másik molekulához, amely biztosítja a proteáz-rezisztenciát. Az alkalmas ellenanyagok vagy más kötődő proteinek könnyen azonosíthatók úgy, hogy egy állatot, például egeret Freund-féle teljes adjuvánsban oldott egyes szálú urikonázzal szemben immu5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
