202584. lajstromszámú szabadalom • Eljárás GM-CSF-fehérje-származékok és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
9 HU 202 584 B 10 Pvu I és Pst I segítségével kihasítjuk a (49) fragmenst, amely tartalmazza a CSF származék DNS szekvenciáját. (49), (26) és (27) fragmensek ligálásával pW 243 hibrid plazmidot (50) kapunk, amely a CSF származékot kódoló rövidített DNS szekvencia vonatkozásában megfelel a (45) plazmidnak. A 2. példa szerinti kifejezéssel olyan fúziós proteint kapunk, amely savas hasítással CSF származékká alakítható, amelyben az első hét aminosav hiányzik. Ez a származék is biológiailag aktív. 7. példa CSF (12-127) Aszintetikus (51) DNS szekvenciát (33) és(16) fragmensekkel ligáljuk, amelynek során (52) hibrid plazmidot kapunk. Ebből Pvu I és Pst I segítségével (53) szekvenciát hasítunk ki, amely tartalmazza a CSF származék DNS szekvenciáját. Az (53) fragmenst (26) és (27) fragmensekkel ligájuk, amelynek során pW 244 hibrid plazmidot (54) kapunk, amely a rövidített CSF szekvencia vonatkozásában megfelel a (45) plazmidnak. A 2. példa szerinti kifejezéssel olyan fúziós proteint kapunk, amely savas hasítással CSF származékká alakítható, amelyben az 1-11 aminosavak eliminálódtak. Ez a rövidített molekula is biológiailag aktív. 8. példa Pro°-CSF (1-126)-Asp A (19) DNS szekvenciát (2. ábra) Bst NI segítségével részlegesen hasítjuk és izoláljuk az (55) fragmenst, amely tartalmazza a CSF szekvencia nagy részét A (33) plazmidot (4. ábra) (vagy egy megfelelő plazmidot, amely tartalmazza a CSF-DNS szekvenciát) először Pst I segítségével, majd részlegesen Bst NI segítségével hasítunk, amelynek során (56) DNS szekvenciát kapunk, amely tartalmazza a CSF szekvencia nagy részét (57) DNS szekvenciát szintetizálunk, amely az (56) szekvenciát DNS szekvenciává egészíti ki, amely alkalmas a CSF származék kódolására, amelyben a C-terminális végen lévő glutaminsavat aszparáginsav helyettesíti. A pUC 13 vektort Pst I és Sma I segítségével nyitjuk és izoláljuk a nagy (58) fragmenst Az (58) maradék plazmidot (56) és (57) fragmensekkel ligáljuk és így pW 245 hibrid plazmidot (59) kapunk, amely C-terminális végén módosított szekvenciát tartalmaz. Az (59) plazmidból SfaNI és Pst I segítségével (60) fragmenst hasítunk ki, amely tartalmazza a módosított CSF-DNS szekvenciát. A (60) fragmenst szintetikus (61) DNS szekvenciával és (55) fragmenssel ligáljuk, amelynek során (62) DNS szekvenciát kapunk. Ezt a (26) DNS fragmenssel és (27) DNS fragmenssel (2. ábra) ligáljuk, amelynek során pW 246 hibrid plazmidot (63) kapunk. Ezt a plazmidot a 8a. ábra kétszer ábrázolja, amelynél az alsó ábrázolásból a kódolt fúziós protein aminosav szekvenciája felismerhető. A 2. példa szerint végrehajtott kifejezéssel olyan fúziós proteint kapunk, amelyből savas hasítással CSF származék nyerhető, amely N-tcrminális végén profínnal van kiegészítve, és amelyben az utolsó aminosav aszparáginsavval van helyettesítve. Ez a származék is biológiailag aktív. 9. példa Pro0-CSF (1-126)-Asp A (63) hibrid plazmidot (8. ábra) EcoRI és Pst I segítségével hasítjuk és izoláljuk azt a fragmenst, amely az IL-2 rész-szekvenciához kapcsolódóan tartalmazza mindkét módosított CSF szekvenciát Ezt a (64) szekvenciát Rsa I-gyel részlegesen hasítjuk és izoláljuk a két (65) és (66) fragmenst A (27), (65), (67), (61) és (60) DNS szekvenciákat ligáivá pW 247 hibrid plazmidot (68) kapunk, amelyben a ligáit szekvenciák a megadott sorrendben követik egymást. A 2. példa szerinti kifejezéssel olyan fúziós proteint kapunk, amely savas hasítással a 8. példa szerinti CSF származékká alakítható. 10. példa Pro0-CSF kódoló gén szintézise Önmagában ismert módon, például a foszfit módszerrel (3 327 007, 3 328 793, 3 409 966,3 414 831 és 3 419 995 számú NSZK-beli közrebocsátási iratok) szintetizáljuk az alábbi három szintézisblokkot I szintézisblokk (CSF-I) - az ábrában (69); II szintézisblokk (CSF-II) - az ábrában (70) és III szintézisblokk (CSF-III) - az ábrában (71). A szintézisblokkok nukleotid sorrendjében berajzoltuk a szintetizált Ia-Im, Ila-IIf és nia-IIIl oligonukleotidokat (melléklet). A szintetizált génhez szolgáló nukleotidok kiválasztásánál nemcsak szinguláris hasítóhelyeket helyeztünk el a három szintézisblokk kapcsolódásánál, hanem a három génfragmens belsejében is elhelyeztünk egy sor szinguláris hasítóhelyet. Ezeket a következő táblázatok tartalmazzák. Ezek a szinguláris hasítóhelyek önmagában ismert módon arra szolgálnak, hogy az aminosavak kódjait kicseréljük, kiegészítsük vagy elimináljuk. Szintézisblokk 1 (CSF I) Enzim Felismerőszekvencia Hasítási hely előtti nukleotid sorszáma (kódolószál) NarI GGiCGCC 1 Hpa II CÍCGG 4 HaelI GGCGCÍC 4 Nae I GCCiGGC 5 Pvu I CGATiCG 13 Sáli GiTCGAC 24 Acc 1 GTiCGAC 25 Hinc II GTCiGAC 26 Hpa 1/ Hinc III GTTlAAC 48 Hhal GCGiC 66 HinfI GlAGTC 88 Nru I TCGiCGA 89 Xma III CiGGCCG 95 Sac II CCGClCG 101 EcoRV gatíatc 128 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 6
