202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
15 HU 202 582 B 16 A 0,5 pM-os törzsoldat elkészítésére 0,091 ml 165 pM- os oldatot adunk 30 ml 2%-os FCS tápoldathoz. Az oldat pH-ját ezután 7,4-re állítjuk be 10 pl 10%-os NaOH oldat hozzáadásával. E törzsoldatokat szűrve stcrilezzük és sorozatkihígítások (1:10 tf/tf) készítéséhez használ- 5 juk fel. Valamennyi sorozathígításnál a megfelelő oldat 3 ml-ét adjuk 27 ml 2%-os FCS-hez. Négy kontrollt készítünk. Az „A” kontroll 0,091 ml 20%-os ecetsavat tartalmaz 30 ml 2%-os FCS lápoldatban; az oldat pH-ját 7,4-re állítjuk be 60 pl, 10%-os NaOH oldat hozzáadásával. A „B” kontroll 0,018 ml 20%-os ecetsavat tartalmaz 30 ml 2%-os FCS tápoldatban, az oldat pH-ját 7,4-re állítjuk be 10 pl 10%-os NaOH oldat hozzáadásával. A „C” kontroll 3 ml „A” kontrolloldatot és 27 ml 2%-os FCS tápoldatot tartalmaz. A „D” kontroll pedig a 30 ml térfogatú 2%-os FCS tápoldat. Az "A” kontrollt az 500 mM-os bIGF-II vizsgálatához, a „B” kontrollt a 100 mM-os bIGF-II vizsgálatához, a „C” kontrollt az 50 mM-os bIGF-II vizsgálatához, míg a „D” kontrollt a 10 mM-os, 5 mM-os, 1 mM-os, 0,5 mM-os és a 0,1 mM-os bIGF-II vizsgálatához használjuk. Amint azt a III. táblázat mutatja, a bIGF-II szignifikánsan növelte az L6 mioblaszlok sejtosztódását a vizsgált koncentrációkban. 10 III. táblázat 1. számú vizsgálat Kezelés WGF-n koncentráció*^ Sejt/cm2 Átlag Standard deviancia Trisz-puffer _ 11508 11778 11643 ±135 bIGF-II 26 nM 13401 12953 13177 ±224 bIGF-I 1 nM 15519 15752 15635 ±116 2% FCS tápoldat 12313 12691 12502 ±189 2. számú vizsgálat Trisz-puffer — _ 8301 — — — bIGF-II 52 nM — 10156 —bIGF-I 1 nM 10869 11004 10731 10868 ±79 2% FCS tápoldat 8930 9676 9109 9252 ±121 3. számú vizsgálat Kezelés Koncentráció1 1) 2 Sejt/cm Átlag Standard deviancia Kontroll A __ 6391 6306 6039 6245 150 bIGF-II 500 nM 11401 11223 10948 11191 186 Kontroll B — 6558 —-6558-bIGF-II 100 nM 14037 13505 13905 13816 226 Kontroll C — 8138 8383 8276 8266 100 bIGF-II 50 nM 12374 11781 12488 12214 310 Kontroll D — 9596 8836 8338 8923 517 bIGF-II 10 nM 12175 11630 11348 11718 343 bIGF-II 5 nM 11414 11239 10871 11175 226 bIGF-II 1 nM 9916 9380 9420 9572 244 bIGF-II 0,5 nM 8739 9135 9030 8968 167 bIGF-II 0,1 nM 8754 8885 8697 8779 79 hIGF-I 1 nM 11419 10653 10857 10976 324 10 nm 13676 13335 13926 13646 242 *! = RIA vagy a HPLC csúcs alatti terület alapján becsülve. 3. példa Ebben a példában azt mutatjuk be, hogy a bIGF-II alkalmas a szarvasmarhaemlő epiléliális sejtek sejtosztódásának serkentésére. Részletesebben, az 1. példa szc- 60 rint tisztított bIGF-II-t vizsgáljuk kollagén gél tenyésztési rendszerben az ilyen sejtek sejtosztódását serkentő hatás vizsgálatára. Az emlősszöveteket 150-200 napja vemhes, még nem tejelő Holstein szarvasmarhákból nyerjük, mészárszékről. A szöveteket apróra vagdaljuk, és 500 ml-es horpasztott, 0,15% (vegyes%) kollagenázzal (Batch, 103-586; Bochringer Mannheim, Indianapolis, Indiana, USA), 0,1% (vegyes%) hialuronidázzal (Type 1, Sigma Chemical Co.) és 5% (tf%) szarvasmarha magzati szérummal (FBS) kiegészített medium 199-et (mindkettő GIBCO) tartalmazó Erlenmeyer-lombikba helyezzük. 5 g szövetre 90 ml teljes oldatot használunk. A diszper-9
