202582. lajstromszámú szabadalom • Eljárás növekedési faktorok előállítására
1 HU 202 582 B 2 Az inzulinszerű növekedési faktorokat (IGF’-ek), mint a növekedés szempontjából biológiailag aktív, például a sejtosztódás során ható peptideket különböző állatfajokból azonosították. Jelen tudásunk szerint e faktorok a szomatotropinok és esetleg más hormonok hatásait szabályozzák. Az inzulinszerű növekedési faktor megnevezést ezen peptidek inzulinszerű struktúráinak és hatásainak kifejezése érdekében választották. Az IGF- ek majdnem 50%-ában homológok az inzulinnal. Háromdimenziós struktúrájukat tekintve a proinzulinra hasonlítanak, így például valamennyien egyláncú peptidek, három diszulfid-híd kcrcsztkötést tartalmaznak, továbbá egy A-lánc részből (A alegység, egy B-lánc amino-terminális részből (B alegység), és egy A-B összekötő láncból (C alegység) épülnek fel. Legalábbis néhány IGF-bcn egy, a karboxil-lcrminális felőli meghosszabbított rész (D alegység) van jelen, ez a proinzulinban nem található meg. Több IGF osztályt azonosítottak az állatokban. Rendesen ezek közé értik az IGF-I-et, az IGF-II-t és másokat. Ezen peptidek keringésben szintjére nézve egy bizonyos mértékben a szomatotropin kontrollja látszik érvényesülni, az IGF-I esetében nagyobb mértékben, mint az IGF-II-nél. Különböző scjtkultúrákban az IGF-ck mitogén hatást fejtenek ki, amelyet például a 3H-timidin beépülésének növekedése alapján lehet mérni. Néhány állatban legalább kétféle IGF-rcceptorcsalád létét bizonyították: az egyik elsősorban az IGF-I-et, míg a másik az IGF-II-t köti, ami az IGF-I illetve az IGF-II eltérő funkcióját sugallja. Az IGF-II biológiai szerepe azonban igen változónak tűnik a különböző emlős fajokban. így például, amíg a patkányokban az IGF-II szintje 20-100-szor magasabb a magzati keringésben, mint az anyáéban, addig az emberi szérum IGF-II szintje a magzatban rendesen alacsonyabb, mint a felnőttben. Potenciális biológiai aktivitása és felhasználhatósága az állatokban a kívánatos sejtnövekedés fokozásában indokolja a már régóta folyó vizsgálatokat a szarvasmarha IGF-II (bIGF-II = bovine IGF-II) aminosav-szekvenciájának meghatározása érdekében csakúgy, mint növekedésfokozó egyéb hatásainak részletesebb megértése, aktív fragmcnscinek jobb megismerése érdekében is. Mindeddig sem ezt a szekvenciát, sem a bIGF-II gén DNS szekvenciáját nem közölték. A patkány- és emberi génbankok vizsgálata alapján úgy tűnik, hogy az IGF-II gének legalább 4 exont tartalmaznak. Az emberi és a patkány IGF-II gének nagy mérete és bonyolultsága olyan mértékben megnehezíti izolálásukat és azonosításukat, hogy ezen gének DNS szekvenciáit teljes mértékben még nem határozták meg. Ám a bIGF-II előállítása és tanulmányozása érdekében végzett kísérletek során felmerült a bIGF-II gén izolálásának és teljes DNS szekvenciája meghatározásának igénye. Ennek megfelelően, a jelen találmány tárgya eljárás nagytisztaságú és/vagy szintetikus peptidek előállítására, melyek a bIGF-II egy vagy több biológiai aktivitásával rendelkeznek, és általánosabban, olyan peptidek előállítására, melyek alapvetően az ilyen aktivitást biztosító aminosavakból épülnek fel, illetve olyan peptidek előállítására, amelyek könnyen átalakíthatok ilyen aktivitású peptidekké. A találmány tárgya továbbá az állati, tartós termelékenységének fokozására, például az izom és/vagy emlő epitéliális sejtek kívánatos növekedését vagy működését elősegítő módszerekkel, a fentebb körvonalazott peptidekkel. A találmány egy további tárgya a fenti peptidek előállítására használható DNS molekulák előállítása. A találmány egy következő tárgya eljárás a fenti peptidek előállítására a fenti DNS-ek segítségével. A találmány további tárgyait a részletes leírásban és a szabadalmi igénypontokban még teljesebben is körvonalazzuk. A találmány elsősorban a bIGF-II és különféle prekurzorai aminosav-szekvenciájának, mint a bIGF-II-t és prekurzorait kódoló DNS molekulák nukleotid-szekvenciájának megállapításán alapul, amint azt az alábbiakban bemutatjuk. A találmány egyik kivitelezési változata szerint néhány új pepiidet állítunk elő, melyek lényegében az alábbiakban következő aminosav-szekvenciájúak, s amely szekvencia megfelel a bIGF-II korábbiakban még meg nem határozott aminosav-sorrendjének (az említett szekvencia amino-terminális végétől kezdve a leolvasást a karboxil-vég felé): Ala-Tyr-Arg-Pro-Scr-Glu-Thr-Leu-Cys-Gly-Gly-Glu-Leu-Val-Asp-Thr-Leu-Gln-Phe-Val-Cys-GIy-Asp-Arg-Gly-Phe-Tyr-Phe-Scr-Arg-Pro-Scr-Ser-Arg-IIe-Ásn-Arg-Arg-Ser-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Glu-Cys-Cys-Phe-Arg-Ser-Cys-Asp-Leu-Ala-Leu-Leu-Glu-Thr-Tyr-Cys-Ala-Thr-Pro-Ala-Lys-Ser-Glu. A találmány egy másik kiviteli változatában olyan különféle módszereket használunk, melyek alkalmasak állati sejtek növekedésének és/vagy más kívánatos funkciói megvalósulásának elősegítésére oly módon, hogy ezen találmány tárgyát képező peptideket az állati szervezetekbe olyan mennyiségben juttatjuk be, amely alkalmas ezen hatások előidézésére. így például, az állati szervezet izomtömege megnövelhető ezen peptidek olyan mennyiségének állatba juttatásával, amely az adott állat izomsejtjeinek osztódását képes előidézni, másfelől, ezen peptideket megfelelő mennyiségben a nőstény emlősállatoknak beadva, az emlő epitéliális sejtjeinek sejtosztódása vagy galaktopoietikus serkentő hatás vagy mindkettő lép fel úgy, hogy az ezt követő tejelválasztás megnövekszik. Találmányunk egy másik kiviteli módja szerint néhány olyan új nukleotid-szekvenciát (DNS molekulát) állítunk elő, amelyek a fentebb leírt peptideket kódolják. Ezek a DNS molekulák jellemzően elsősorban a következő nukleotid-szekvenciát (vagy ezen nukleotid szekvenciáknak a fehérjeszintézis szempontjából működőképes megfelelőit) tartalmazzák: 5’ - GCT TAC CGC CCC AGC GAG ACT CTG TGC GGC GGG G AG CTG GTG GAC ACC CTC CAG TTT GTC TGT GGG GAC CGC GGC TTC TAC TTC AGC CGA CCA TCC AGC CGC AZA AAC CGA CGC AGC CGT GGC ATC GTG GAA GAG TGT TGC TTC CGA AGC TGC GAC CTG GCC CTG CTG GAG ACT TAC TGT GCC ACC CCC GCC AAG TCC GAG-3’. A találmány egy következő kiviteli módja olyan eljá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
