202577. lajstromszámú szabadalom • Rögzített enzimelektródok
1 HU 202 577 B 2 A találmány olyan enzimelektródokra vonatkozik, amelyek egy enzimet egy elektromosan vezető szubsztrát felületén rögzítve tartalmaznak, és amelyek amperometrikusan reagálnak az enzim katalitikus aktivitására az enzim megfelelő szubsztrátuma jelenlétében. A találmány különösen - de nem kizárólagosan - olyan enzimelektródokra vonatkozik, amelyek glukóz szintek in vitro és in vivo kimutatására egyaránt alkalmazhatók. Ezek lényeges eleme egy elektromosan vezető hordozó, amelyen egy redox enzimet - pl. egy glukózoxidázt - rögzítünk. Az elektród amperometriásan reagál a rögzített enzim katalitikus aktivitására, amely egy glukózt tartalmazó mintába való bevitel során megnyilvánul. Az enzimet mint biokatalizátort tartalmazó amperometrikus bioszenzorok előnyeit bizonyos részletességgel tárgyalja Aston és Tumer - Biotech. Genet. Eng. Rev. (kiadó G. Russel) 1,89-120,1984. Intercept, Newcastle-upon-Tyne - és G. Davis - Biosensors 1, 161— 178,1985 -. Ezek a bioszenzorok a jelátvitel módjában különböznek és megközelítően a következő csoportokba sorolhatók: a) az elektromos válasz forrása az elektródon végbemenő enzim-reakció termékének oxidációja; b) egy „mediátor” segítségével működők; ezekben az elektronokat az enzimről az elektródra egy redox reagens viszi át és c) „közvetlen elektron átvitel” (DET) alapján működők; ezekben nincs szükség ilyen mediátor igénybevételére. a) Kategória Ez a kategória bizonyos oxidázok (pl. glukózoxidáz, alkoholoxidáz) hatására való hivatkozással jellemezhető; ezek az enzimek a következő reakció szerint hidrogénperoxidot termelnek: szubsztrát + 02 -(oxidáz)-» oxidált termék + H202 Ennek az eljárásnak a keretében a peroxid oxidálódik a meghatározott feszültségre beállított elektródon: H202 —» 02 + 2H+ + 2e Az elektronoknak a peroxidból az elektródra való átvitele után elektromos jel képződik, és megfelelő körülmények között az enzimes katalízis folytán keletkező áram erőssége arányos a meghatározandó anyag koncentrációjával. Számos, glukóz meghatározására szolgáló berendezést írnak le, ezek legtöbbjét azonban korlátok jellemzik, ami a válasz reprodukálhatóságát és sebességét, valamint a meghatározható glukóz tartományt illeti. Néhány, mérsékelten sikeresnek mondható nagyléptékű módszer peroxidnak az alábbiak szerinti felhasználásán alapul, amikor is glukóz a szubsztrátum és az oxidáció terméke glukono-l,5-lakton. Más eljárások a peroxid szekunder reakcióit (pl. kolorimetriás vizsgálatok) vagy fizikokémiai méréseket (pl. vezetőképesség mérést) vesznek igénybe. Általában jellemző azonban ezekre, hogy lassú a válasz és hátrányos az a körülmény, hogy meglehetően érzékenyek a mintában jelenlevő oxigén nyomására, amely nagyon jelentős mértékben változhat. Alacsony oxigénnyomás mellett az áram-válasz linearitásának felső határa alacsonyabb lehet, mint az egyszerű, pontos mérések esetében megkívánt érték. Hasonló meggondolások érvényesek a glukóztól különböző szubsztrátumok indirekt vizsgálati módszerei vonatkozásában is. b) Kategória - Mediátor igénybevételével működő bioszenzor Ezeknek a készülékeknek az esetében az enzim a szubsztráttal végbemenő reakció eredményeként redukált („elektronokban gazdag”) állapotban marad vissza; a szubsztrátum az az anyag, amelynek koncentrációját meg kell határoznunk. A gyakorlatban alkalmazható szenzor vonatkozásában az egyik követelmény az, hogy elektromos kapcsolat jöjjön létre az elektronforrás (az enzimen belül egy elektrondús „aktív hely”) és maga az elektród között. Mivel azonban az aktív helyek hajlamosak arra, hogy a makromolekuláris enzim szerkezeten belül a repedésekben vagy hajlatokban rejtve maradjanak, az ezekhez való hozzájutás teljesen vagy részben blokkolt Ezért bizonyos nehézségekkel jár egy olyan elektromos kapcsolat létesítése, amely a megbízható és érzékeny jelátvitel szempontjából kellő mértékben hatékony. Elektronoknak egy enzim és egy elektród között való átvitele azonban megkönnyíthető egy olyan elektronhordozó - vagy „mediátor” - beiktatásával, amely az oxidált alakban az enzimből elektronokat vesz fel, majd a redukált alakban átviszi ezeket az elektródra, amelyen újra oxidálódik. Mediátorok alkalmazása az utóbbi időben leírt olyan bioszenzorok segítségével illusztrálható, amelyek szén elektródon rögzített glukózoxidázt alkalmaznak. Az egyik berendezésben kovalensen kötöu, a cianursavkloridos módszerrel rögzített enzimet (Jonsson és Gorton, Biosensors 1, 355-369, 1985) használnak fel, amely állítólag jó (több hónapos) stabilitással jellemezhető. A szenzornak komoly hátránya azonban az, hogy az alkalmazott mediátor, az N-metil-fenazinium ion (fenazin-metoszulfát) labilis és könnyen kimosható, ami a használat során napi újratöltést tesz szükségessé. Az elektród érzékeny az oxigén koncentrációra is, bár kimutatták, hogy a mediátor segítségével történő elektrokémiai átvitel hatásosan konkurál az oxigént redukáló reakcióval. Egy másik bioszenzorban, amely ugyancsak rögzített glukózoxidázt tartalmaz, mediátorként ferrocént vagy ennek valamelyik származékát alkalmazzák (Cass et al., Anal. Chem. 56, 667-673, 1984 és 0 078 636 sz. európai szabadalmi bejelentés). Az elektronoknak a mediátor segítségével az elektródra történő átvitele a következőképpen megy végbe: glukóz + (oxidált) enzim -» glukono-l,5-lakton + (redukált) enzim (redukált) enzim + (oxidált) fenocén —> (oxidált) enzim + + (redukált) ferrocén (ferricinium ion) (redukált) ferrocén —> (elektront az elektródhoz) -» ferricinium ion Ennek az elektródnak a mechanikai jellemzői - működésének részletei - nem egyértelműek. Konkrétan nem áll rendelkezésre magyarázat arra vonatkozóan, hogy a ferrocén nagymértékben oldhatatlan redukált alakja hogyan szállítja a töltést az elektródhoz, a mediátor ciklikus aktivitásának fenntartására (bár ez az ellenvetés nem feltétlenül érvényes az ionos ferrocén származékok vonatkozásában). Ezen kívül: a válasz meglehetősen lassú, különös tekintettel arra, hogy potenciálisan nagyon gyors válasz lenne várható az itt szerepet játszó enzimreakciók ismert sebessége alapján, továbbá az elektród élettartama korlátozott, ami az enzim korlátozott stabilitásának tulajdonítható. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
