202558. lajstromszámú szabadalom • Eljárás neuronotrófiás faktor kinyerésére és ilyen hatóanyagot tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására
HU 202558B tűk az inkubáló közeg eltávolításával és négyszeri gyors öblítéssel jéghideg PBS-sel. A 3H-dopajnint mindegyik tálból extraháltuk kétszer 0,5 cm3 0,4 mól/1 Ha04-tal, víz és abszolút etanol 3:1 térfogatarányú elegyében, 15-15percig.Akinyerés95% felett volt. A radioaktivitás méréséhez 10 cm3 Instagel n-t (folyékony szcintillációs számláló közeg) adtunk hozzá, és Packard TriCarb (Model 460 C) szcintillációs számlálóval mértünk. Egyes mintákból az inkubálás és a mosások után kivontuk a sejten belüli radioaktivitást 0,5 cm3 0,4 n perklórsawal, és nagynyomású folyadékkromatográfiával (HPLC) analizáltuk (C. Kotake és mts., J. Neurosci., 2,1307 /1982/); A Shum és mts.: J. Chromatog., 228,123 /1982/). A bevitt radioaktivitásnak több, mint 95%a abban a frakcióban jelentkezett, amely a dopamin retenciós idején eluálódott. A 14C-GABAspecifikusfelvételét A.Prochiantz és mts. (Nature, 293,570 /198 If) módszerével értékeltük. 0,1 pmól/114C-GABA (225 mCi/nmól) hozzáadásával 15 percig 37 °C-on inkubáltuk. A GABA katabolizmusát 10 pmól/1 amino-oxiecetsavval akadályoztuk meg. Szükség esetén 1 mmól/1 diamino-vajsavat is adtunk az elegyhez mint GABA-felvételi inhibjtort. A mosási és extrahálási eljárások azonosak a 3H-dopamin felvételi vizsgálatoknál alkalmazottak. A GABA azonosítását vékonyrétegkromatográfiás (TLC) módszerével végeztük (R.S. Lasher: Brain Res., 69,235 /1974/). A radioaktivitásnak több, mint 90%-a a hiteles GABÁ-val együtt vándorló foltban volt. 4. Asejttenyészet morfológiai értékelése, életképessége és biokémiai jellemzése A tálban feltapadó, életképes sejtek több, mint 98%-a mind 4, mind 8 nap után in vitro pozitívan immunreaktiv és RT97-es monoklonális antitestekkel immuncitokémiaüag festhetők voltak. Sőt a tenyészetben levő sejtek kevesebb, mint 1%-a a teljes vizsgálati idő alatt immunreaktóv volt GFAP antszérumos festéssel szemben. Mindez azt mutatja, hogy a tenyészetben levő sejteknek több, mint 98%a neuronhoz tartozónak tekinthető. A tenyészetben levő dopaminerg neuronok vizuálisan meghatározott száma azt mutatja, hogy ezek a sejtek azin vitro jelenlevő teljes sejtpopulációnak mintegy 0,1- 0,2%-át teszik ki. A vizsgált tenyészeben levő sejtek életképessége 4 napig nem változott in vitro. A 4. és 8. nap között azonban az életképesség 60-80%-ka csökkent. Ez nemcsak a morfológiai vizsgálatból tűnt ki, hanem az azt követő DNS-tartalom vizsgálatból és a dopaminerg sejtek tálankénti számából is. Ez azt mutatja, hogy a középagyi idegsejtek életképessége az alkalmazott tenyésztési körülmények között korlátozott, és a tenyészetben jelenlevő, különböző típusú sejtek életképessége között nincs érzékelhető különbség (lásd 4. ábra). A 4. ábra diagramja az összes neuronok, a GIF- pozitív neuronok számának és a BZT-érzékeny dopamin-felvétel időfüggését mutatja. A tenyésztési közeget 1.106 sejt/2cm tenyésztő közeg 35 mm-es tálban mennyiségű középagyi sejttel oltottuk be. A 4. ábra jelzései a következők: DNS-tartalom tálanként (.-.); BZT érzékeny dopamin-felvétel (o-11 o); GIF-pozitív sejtek száma tálanként (üres hisztogram); BZT-érzékeny dopamin-felvétel 1000 GIF-pozitív sejtre számítva (vonalkázott hisztogram). A sejtek életképességének meghatározásához hasonlóan a Tl-dopamin és a 4C-GABA specifikus felvétele is csökkent a tenyészetben 60-80%kal a 4. és 8. nap között in vitro. Ez is arra utal, hogy nincs látható különbség a jelenlevő, különböző típusú sejtek in vitro viselkedése között, és igazolja, hogy ezek a felvételi paraméterek megfelelően jelzik a sejtek in vitro életképességét. 5. A tisztítási eljárás fő lépései után kapott anyagok biológiai aktivitása Ennek meghatározására a tisztítás fő lépéséből származó, fagyasztva szárított anyag aliquot részeit közvetlenül a használat előtt az eredeti térfogathoz képest 1/10-nyi desztillált vízben újra szuszpenzáltuk. A fehérjetartalmat GX. Peterson (Anal. Biochem., 83, 346 /1977/) szerint határoztuk meg. A mintákat ezután a tenyésztő közeggel felhígítottuk 0,45 pm-es Millex szűrőn átszűrtük, és 1 mg/cm3 marha szérumalbuminnal telítettük. A leszűrt anyag kívánt mennyiségét a felkenés napján hozzáadtuk a középagyi sejtek tenyészetéhez. Azonos mennyiségű marha szérumalbumiat adtunk a kontroll sejttenyészetekhez is. A közeget kétnaponként cseréltük, vagy a tisztítási lépésből származó anyagot (ill. a kontroll tenyészetek esetés az albumint) utánpótoltuk. Mindegyik fő tisztítási lépés utáni anyag - a nyers felülúszó kivonat a teljes homogenizátum savas kicsapása után, a Sephadex G-150 oszlopról eluálódó, 10 és 30 kilodalton közötti móltömegű frakció és a TSK-CM-3SW oszlopról az 1 mól/1 ammónium-acetáttal eluálódó frakció nölveni tudta a tenyészetben levő, disszociált, fötális, középagyi idegsejtek életképességét, vagyis túlélését és fejlődését. A nyers felülúszó frakció ill. az albumin (kontroli-tenyészet) morfológiai megjelenését mutatja az 5A és 5B. ábra a felkeoés napján (0. nap) hozzáadott tenyésztési közeggel in vitro végzett sejttenyésztés 8. napján. Az ábrák az egér fötális, középagyi sejtjeinek tipikus képét mutatják in vitro, 8 nappal azután, hogy hozzáadtunk 10 pg/cm3 albumint a kontroli-tenyészethez (5A ábra) és 10 pg/cm3 felülúszó kivonatot a teljes homogenizátum savas kicsapása és dialízise utáni lépésből (5B. ábra). Ez a hatás bebizonyosodott az össz-DNS tartalom meghatározása, az egyes tálakban talált dopaminerg sejtek száma (6. ábra), a 3H-dopamin és a 14C-GABA specifikus in vitro felvételének időfüggése alapján is. A 6. ábra a GIF-pozitív (azaz dopaminerg) sejtek számának és a tálankénti DNS-tarűd ómnak az értékelését mutatja az in vitro sejttenyésztés nyolcadik napján, 10 pg/cm3 albumin (kontroli-tenyészet, üres hisztrogramm) ill. a teljes homogenizátum savas kicsapása és dialízise utáni felülúszó 10 p/cm3- ének (vonalkázott hisztogramm) hozzáadása után. Az értékek három analízis kőzépértékeit és (±) a középérték standard hibáját adják meg. A 7. ábra azt mutatja, hogy a fenti felülúszó hatása a dopamin-f elvételre koncentrációfüggő. Ugyanezt észlel-12 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
