202471. lajstromszámú szabadalom • Eljárás amino-pimelinsav-származékok és a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202471 B 2 elánnal készített oldatát és a kapott szuszpenziót 16 órán keresztül 0 °C-on, majd 4 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük. Ezután leszűrjük és szárazra pároljuk. Az olajos maradékot 10 cm3 éterrel felvesszük, szűrjük és szárazra pároljuk. 1,03 g nyers terméket kapunk, amelyet szilícium-dioxidon kromatografálva tisztítunk. Eluálószerként ciklohexán/etüacetát 5:5 arányú keverékét használjuk. 410 mg kívánt terméket kapunk. NMR-spektrum (0X33,250 MHz), ppm: C02Et: 1,29 (t)-4,21 (p) CH2-: 2-2,66 OÍ-C02C03:3,06 (d) CO2-CH3:3,69-3,77 és 3,78 (7) képletű csoport H-ja: 4,54 (m), 4,63 (m) CH=CH: 5,42 (m), 5.63 (m) NH-C-0:6.40(d), 8,54. B lépés 6-[gamma-D-Glutamil)-amino]-3-heptén-disav 454 mg A lépésben előállított terméket 20 cm3 etanolban oldunk, az oldatot 0 °C-ra hűtjük és hozzáadunk 3,6 cm3 normál nátrium-hidroxidot. Az elegyhez keverés közben hozzáadunk 1 cm3 vizet és 16 órán keresztül szobahőmérsékleten kevertetjük. A reakcióelegyet ezután csökkentett nyomáson besűrítjük, a maradékot 2 cm3 vízzel felvesszük és a pH értékét 2 n sósav oldattal 6-ra állítjuk be. A tisztítást Dowex 50 W x 8 ioncserélő gyantán végezzük. Eluálószerként vizet, majd ammónium-hidroxidot használunk. 272 mg terméket kapunk, amelyet 10 cm3 vízben oldunk, majd liofilizálunk. 215 mg kívánt terméket nyerünk ki [alfajD - -18° ± 2° (c - 0,5%, HCIóN) NMR-spektrum (D2O, 300 MHz), ppm: CH2-CO2H: 2,95 (d, gamma - 7H2) CH-CH: 5,64 (d, J-15,5 és 7H2), 5,49 (7) képletű csoport H-ja: 3,77 (t), 4,21 (dd) 19 példa Tabletta készítése Tablettákat készítünk a következő összetétellel: 6. példa terméke 50 mg vivőanyag q. s. 250 mg-ig (a vivőanyag összetétele: laktóz, keményítő, talkum, magnézium-sztearát) 20. példa Tabletta készítése A következő összetételű tablettát állítjuk elő: 2. példa terméke: 50 mg vivőanyag q.s. 250 mg-ig (a vivőanyag összetétele: laktóz, keményítő, talkum, magnézium-sztearát). Farmakológiai vizsgálatok Monocyta-sejtek serkentése immun-stimulánssal Egészséges donorok vérében keringő mononukleáris sejteket Ficoll gradienst használva a Boyum által leírt standard technika szerint szeparáltunk. Mosás után a mononukleáris sejteket inkubáltuk 37 °C-on, 1 órán át, 5 x 106monocitát(NSE+sejtek) táptalaj milliliterenként, 5 ml-t fiolánként Ebben a kísérletben RPMI 1640-es táptalajt használtunk, antibiotikum és Hapespuffer hozzáadásával Egy óra leteltével a nem kitapadó sejteket előzetesül 37 °C-osra melegített oldatos mosással el távoli tottuk, a kitapadó sejtek legnagyobb része (C90%) monocita, ezeket teljes RPMI-közeges táptalajba helyeztük vissza, szérum nélkül, különböző mennyiségű kipróbálás alatt álló tennék jelenlétében, amelyeket előzőleg Ca2+ - és Mg2+ -mentes pufferoldatba (Dulbecco) helyeztünk. A tenyésztést tovább folytattuk 24 vagy 48 órán át és a sejtek felüluszóját eltávolítottak, centrifugáltuk, egyenlő mennyiségekre különítettük el és - 80 °C-on vagy - 20 °-on tartottuk. A táptalaj felülúszóját a fiolákban megfelelő mennyiségű, csíramentes desztillált vízzel helyettesítettük, hogy a sejtek feloldódjanak. A visszanyert lizátumot egyenlő mennyiségekre különítettük el és szintén - 20 °C-on tároltuk. A következő kísérletet 103 U/ml gamma—Interferon (a dózisnál csak a gamma IFN inaktív) jelenlétében, vagy hiányában végeztük. Teszt a monokinek (Interleukin-1 és Tumor Nekrózis Faktor) jelenlétére a felülúszókban, biológiai aktivitásuk kimutatásával Ezt a tesztet először I. Gery és Waksman írta le 1972-ben (Gery I. és B. H. Waksman: 1972, Potentiation of the T lymphocyte response to mitogens. II. The cellular source of potentiating mediator (s) J. Exp. Med., 136-143). Ez - a tesztben fitohemaglutininnel utánzóit - antigén jelenlétében IL-1 egér-timocitákra való ko-mitogén hatásán alapul. 1,5 x 106 C3H/HeJ (az Orleans-i C. S. E. A. L.-ből) egértimocitát három napra felülúszó különböző hígítása, IL-1 aktivitást tartalmazható sejt-lizátumok és PHA-P Wellcome (l.pg/ml) jelenlétében táptalajra helyeztünk, táptalaj-lemezekre 96 laposfenekű lyukba, 200 pJ-es végtérfogattal, amely antibiotikumon (1 U/ml penicillin, 1000 U/ml streptomicin), 1 mM Hepes-pufferon, 2 mM glutaminon, 5% borjúszérumon és 5 x 10'5 M 2-merkapto-etanolon kívül RPMI 1640-et tartalmazott. 68 óra tenyésztés után 1, p.Ci triciált timidint adtunk minden kúthoz (3H-metü-timidin, CEA Saclay, TMM79A specifikus aktivitás 1 Ci/mM - 37 GBq/mM) a sejtek által felvett radioaktivitást a tenyészetek Skatron típusú félautomata gyűjtőrendszeren történt szűrése és a szűrők folyadék-szcintillációs számlálóban (Beckman) történt számlálása után értékeltük. Az eredményeket a felülúszók jelenlétében készült, illetve a kontrolltenyészetek által felvett percenkénti impulzusszámok különbségével fejeztük ki. Tumor Nekrózis Faktor (TNF) teszt A TNF aktivitást e faktor L-929 célsejtekre (a szubklón) gyakorolt toxikus hatásával fejezzük ki. A módszert aktinomicin-D hozzáadásával érzékenyítettük. Az L-sejteket lyukankénti 2 X 104 sejt arányában 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 15
