202415. lajstromszámú szabadalom • Eljárás átmenő pórusokkal rendelkező membrán szerkezetek előállítására és hatékony pórusméretének változtatására
7 HU 202415 B 8 rusméret desztillált vízben mintegy 4 nm. lg kipreparált sejtfalat 50 mM, 7,2 pH-jú TR1S-HCl-pufferral 'készített 5 M guanidin-hidroklorid-oldat 5 ml-jével 25 °C-on 2 órán át keverjük t.TRIS" itt és a továbbiakban trisz(hidroximetil)-aminometánt jelent]. A sejtfalak felületéről az úgynevezett S-rétegek glikoproteinmolekulái leválnak. Az extrahált sejtfalakat centrifugálással ülepítjük (20 000 g mellett 1 óra), és a glikoproteinmolekulák a felülúszó részben maradnak. A glikoproteinmolekulákat tartalmazó extraktumból a guanidin-hidrokloridot eltávolítjuk, desztillált viz (pH 5,5) vagy 50 mmólos TRIS-puffer (pH 7,2) ellen dializálva, amikor is a glikoimilfini'k 0[iH/.(írvi;zftdéH<! következtében vezikuláris állapotban lévő membránvezikulumot 50 mmólos, 7,2 pH-jú foszfátpuff er ban 2%-os glutáraldehid-oldattal 20 °C-on 2 órán át kezelve térhálósitjuk, amikor is a glikoproteinek között intra- és intermolekuláris kötések jönnek létre. A térhálósitó szer kimosása után a membránvezikulumok hatóanyaggal tölthetők. E célból a membránvezikulumokat a hatóanyag, például 67-70 kD mólsúlyú protein 0,9%-os, 5,5 pH-jú nátrium-klorid-oldattal készített 10 mg/ml koncentrációjú oldatában szuszpendáljuk. Az oldatban uralkodó környezeti viszonyok mellett a pórusok kitágulnak, és a hatóanyag a pórusokon bejut a vezikulumba, míg a koncentráció ki nem egyenlítődik. A szuszpenziót 15 000 g mellett 1 órán át centrifugálva a vezikulumokat ülepítjük, majd desztillált vízen szuszpendáljuk (pH 5,5). A közeg célirányos változtatása (nétrium-klorid-oldatról desztillált vízre) következtében a hatékony pórusméret oly mértékben csökken, hogy a bezárt hatóanyag nem tud kilépni a pórusokon, így benne marad a vezikulumban. A hatóanyag felszabadítása céljából a membránvezikulumokat újból olyan közegbe kell juttatni, amelynek ionerőssége mintegy megfelel a membránvezikulumok megtöltésekor használt közeg ionerősségének. Az alábbi 3. példában átmenő pórusokkal rendelkező membránokból felépülő szerkezetek előállítására olyan előnyös eljárást mutatunk be, amelyek a már többször említett európai szabadalmi leírásban ismertetett szerkezetek állíthatók elő, mégpedig oly módon, hogy a protein-, illetve proteintartalmú molekulák és az ezekből a molekulákból felépülő rétegfragmensek nagyobb membránokat (a 0 154 620 sz. európai szabadalmi leírásban P-membránok) eredményező önszerveződése nem zajlik le. 3. példa: Membránszerkezet kialakítása A Bacillus stearothermophilus PV 72 jelű törzsének ép sejtjeit (nedves súly: 10 g) 40 ml TRIS-HCl-pufferban (50 mmólos, pH 7,2) szuszpendáljuk, majd ultrahang behatásával feltárjuk. Autolitikus folyamatok gátlása céljából a szuszpenziót jeges fürdőben hütjük. A szuszpenzió sejtfalfragmenseit 20 000 g mellett centrifugálva pelletezzük, és a pelletek alsó végét (amely még ép sejtekből áll) újból szuszpendáljuk és ultrahanggal kezeljük. Utána a sejtfalfragmenseket 20 000 g mellett centrifugálva ülepítjük, újból szuszpendáljuk, majd 0,5%-os TRITON X-100 (50 mM TRIS-HCl-pufferban, pH 7,8) detergenssel 20 °C-on 20 percen keresztül dezintegráljuk a citoplazma-membránt (lipid bői álló kettős réteget) róluk (.TRITON X-100' itt és a továbbiakban a kimélö detergens hatású oktilfenol-polietilén-glikolétert jelenti). Utána a sejtfalfragmenseket többszörösen mossuk. Az így tisztított sejtfalfragmensek a glikoproteinmolekulákból felépülő S-rétegből és az alatta lévő, peptidoglikánból álló táraasztórétegböl áll. A sejtfalfragmensek felületének méreteit elektromikroszkóppal ellenőrizzük, az átlagos méret 500 nm legyen. A sejtfalfragmensek segítségével olyan ultraszűrómembránt készítünk, amelynek lényeges tulajdonságai a 0 154 620 sz. európai szabadalmi leírás 2. példájában ismertetett ultraszürómembrán tulajdonságaival azonosak. Az ultraszürómembrán hordozó membránjaként 100 nm átlagos pórusátmérőjü ultripor N66 típusú nejlon mikroszürőmembránt (gyártja: Pali cég, Cortland, N. Y. Amerikai Egyesült államok) alkalmazzuk. A hordozó szabad amino- és karboxilcsoportokat tartalmaz 1:1 arányban. További reakcióképes aminő- és karboxilcsoportok kialakítása céljából a mikroszürőmembránt 50 °C-on 60 percen át 3,6 n sósav-oldattal kezeljük, majd desztillált vízzel mossuk és ultraszüró berendezésbe (a 0 154 620 sz. európai szabadalmi leírás 1. példájában és 5. példájában ismertetett berendezéshez hasonló) helyezzük. A sejtfalfragmenseket a 0 154 620 sz. európai szabadalmi leírás 1. és 2. példája szerint, úsztatással visszük fel a hordozóra, illetve be a hordozó mátrixába. Egyenletes rétegképződés érdekében a kiindulási szuszpenzió 5 ml-jét 50 ml desztillált vízzel hígítjuk. A hígított szuszpenziót beletöltjük az ultraszürő-berendezésbe, ahol a szuszpenzió rétegként helyezkedik el a szürömembránon. Ezt követően nitrogén bevezetésével a membrán felett 2.10s Pa túlnyomást létesítünk, aminek nyomán a folyadékfázis átpréselödik a membránon, a sejtfalfragmenseket a membránra vagy a membránba úsztatva; a felületegységre eső proteinmennyiség 30 jug/cmz. Utána az ultraszüró-berendezés felső, részében elhelyezett fúvókán keresztül 3.103 * 5 Pa légnyomással 7,0 pH-jú, 0,1 mólos nátrium-kakodilát-pufferral készített 0,5%-os glutár-dialdehid-oldatot permetezünk a hordozóra deponált sejtfalfragmensekre, térhálósitó gyanánt. A térhálósitó oldat a túlnyomás következtében folyamatosan migrál a sejtfal-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
