202323. lajstromszámú szabadalom • Eljárás prosztaglandin E2 tartalom radioimmunológiai meghatározására
1 HU 202 323 B 2 A találmány tárgya eljárás a prosztaglandin E2 (továbbiakban PGEi) radioimmunológiai meghatározására, melynek során megmérjük jód-125-izotóppal jelzett nagy fajlagos aktivitású PGE2-származék mint nyomjelző anyag (továbbiakban radioligandum vagy tracer) specifikus antitesthez való kötődését ismert mennyiségű, különböző koncentrációjú standard oldatok és a meghatározandó minták jelenlétében, majd a standardokhoz tartozó kötésváltozások ismeretében a mintákhoz tartozó kötésváltozásokból kiszámítjuk azok hatóanyagtartalmát. Ismert, hogy a különböző kémiai szerkezetű prosztanoidok közül a PGE2 az egyik legelterjedtebb, legöszszetctlebb biológiai hatásokkal rendelkező vegyület. Mennyiségi meghatározására az alacsony élettani koncentrációk miau a radioimmunoassay (továbbiakban RIA) az egyik legelterjedtebb módszer. Ehhez a különböző források vagy tríciummal [pl. Science 171, 494 (1971), J. Clin. Invest 52, 398 (1973), Febs. Lett. 37, 192 (1973), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 75,2689 (1978)], vagy jód-125 izotóppal jelzett tracert (pl. Eur. J. Clin. Invest. 5, 311 (1975), Biochim. Biophys. Acta 437, 139 (1976), Developments in Pharmacology, Marlinus Nijhoff, 1980, p. 17, Methods Enzymol. 86, 297 (1982), Prosta. Leuk. M. 12, 11 (1983), Prosta. Leuk. M. 18, 81 (1985)) alkalmaznak. Utóbbi célra elterjedten használják a PGEz jód-125-tel jelzett monojód-tirozin-metilészter származékát (továbbiakban: 125I-PGE2-TME) [Biochim. Biophys. Acta 431, 139 (1976), Izotóptechnika 22, 190 (1979), J. Chromatography 438, 111 (1988)], amely egyúttal az egyetlen kereskedelmi forgalomban lévő, radiojódos jelzésen alapuló RIA-mérőkészlet tracere is. A tríciummal jelzett tracer kémiai szerkezete azonos az inaktív ligandummal („homológ RIA”), míg a jód- 125 radioligand előállításához az alapmolekula kémiai átalakítása szükséges, tehát a radioligandum és az inaktív ligandum kémiailag különbözők („helcrológ RIA”). A tríciummal jelzett tracer alkalmazásánál előnyt jelent, hogy az izotóp viszonylag hosszú (mintegy 12 év) felezési ideje miau a tracer stabilnak tekinthető, és az ilyen traceren alapuló RIA-k pontossága, reprodukálhatósága ennek eredményeképpen általában igen jó. A125I- izotóppal jelzett tracerek előnye viszont az olcsóbb előállítás és az egyszerűbb, olcsóbb méréstechnika, valamint a tríciumhoz képest mintegy tízszeres moláris aktivitás. Ismert, hogy ugyanazon antitest esetében a radioimmun meghatározás kimutatási határa egyenes arányban csökken, vagyis érzékenysége egyenes arányban nő a tracer fajlagos aktivitásával. Elméletileg tehát az várható, hogy tízszer nagyobb fajlagos aktivitású tracer használatával a radioimmun meghatározás érzékenysége tízszeresére nő. Ennek ellenére a 125I-PGE2-TME traceren alapuló, eddig ismert radioimmun meghatározásokban az érzékenység a homológ RIA-hoz viszonyítva általában nem növekszik a jód-125-tel jelzett tracer nagyobb fajlagos aktivitása alapján várható aranyban. A technika jelen állása mellett a homológ RIA-hoz alkalmazott tríciummal jelzett PGE2-vel maximálisan mintegy 200 Ci/mmól, míg a 1J5I-PGE2-TME tracerrel mintegy 2000 Ci/mmól moláris aktivitás érhető el. A tízszeres fajlagos aktivitásnövekedésnek megfelelően ideális esetben tízszer nagyobb érzékenységet kellene kapnunk, ezzel szemben a klasszikus egyensúlyi RIA-ban 125I-PGErTME tracerrel elért érzékenység gyakran azonos, vagy csak kisebb mértékben nő a homológ RIA-ban elért érzékenységhez képest. Napjainkig mindössze két olyan adatot ismerünk a szakirodalomban, ahol a 125I-PGEj-TME tracer felhasználásával elért érzékenység lényegileg megfelel az izotóp fajlagos aktivitása alapján elméletileg várható értéknek [Biochim. Biophys. Acta 431, 139 (1976), Prosta. Leuk. Med. 18, 81 (1985)], közülük is az utóbbi valódisága erősen kétségbevonható. Az összes többi irodalmi adat szerint hasonló körülmények között nem érhető el érzékenységnövekedés. A találmány célja az, hogy a hagyományosan alkalmazott egyensúlyi RIA reagenseinek felhasználásával jelentős - optimális esetben akár az elméletileg várható maximális - érzékenységnövekedést lehessen elérni. A találmány alapja az a felismerés, hogy a ,25I-PGE2- -TME rádióiigandumon alapuló heterológ radioimmunoassay csökkent, illetve a vártnál kisebb mértékben növekedett érzékenységének oka a tracer-antitest kötésnek az inaktív PGE2-antitest kötésnél nagyobb asszociációs egyensúlyi állandója, és így az egyensúly beálltakor a tracer antitesthez kötött frakciója nagyobb, mint azonos egyensúlyi állandónál volna. Felismertük tehát, hogy az elterjedten használt egyensúlyi módszerrel azonos reagensek felhasználásával és a módszer összes előnyének megőrzése mellett az érzékenység úgy növelhető, hogy az antitesthez kötött összes (aktív és inaktív) ligandumon belül csökkentjük a tracer arányát, mégpedig úgy, hogy egy szekvenciális telítési elven alapuló meghatározási módszert alkalmazunk. így elérhető, vagy legalábbis megközelíthető az az érzékenység, amelyet a jód-125 izotóp fajlagos aktivitása elméletileg biztosítani képes. Ismert ugyanis a RIA irodalomban, hogy az antitest korlátozott számú kötőhelyeiért az inaktív és a jelzett antigén vetélkedik, és a folyamat egyensúlyra vezet. Az egyensúly elérése után az antitesthez kötött radioligandum mennyisége az egyensúlyi állandónak megfelelő koncentrációviszonyok szerint fordítottan arányos a rendszerben lévő inaktív antigén koncentrációjával. Az engyensúlyi módszertől elvileg különböző változatban, az ún. szekvenciális telítési analízisben ugyanazon komponenseket használják, mint az egyensúlyi RIA- ban, de először az inaktív antigént nagy feleslegű antitesttel előinkubálják, így az egyensúly elérésekor az inaktív antigén teljes mennyisége antitesthez kötött formában van. A tracert ezt követően adják a rendszerhez, ahol az antitcstfelesleg miatt elvileg nincs vetélkedés az inaktív és jelzett antigén között, utóbbi csak a szabad kötőhelyeket foglalhatja el, ezért az érzékenység nő (Radioimmunoassay, Medicina, Budapest, 1986, p. 21). Elméletileg várható, hogy a heterológ RIA-ban az alapmolekula kémiai átalakítása miatt a radioligandumra és az inaktív ligandumra ugyanazon antiszérum esetén érvényes egyensúlyi állandó jelentősen különbözhet, és az egyensúlyi RIA-ban e két állandó viszonya döntően befolyásolja a Rí A érzékenységét így a Radioisotopes in Medicine: In Vitro Studies, Oak Ridge T. N. U. S. Atomic Energy Committee, 1969, p. 59 irodalmi hely által ismertetett elméleti számítások alapján például, ha a tracer-antitest kötés egyensúlyi állandója tízszerese az inaktív ligandum-antitest kötés egyensúlyi állandójának, akkor az érzékenységet jellemző 50%-os 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
