202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
57 HU 202288 B 58 Az E.coli W3110& 102/pML310/l törzs tenyésztése laboratóriumi méretekben Az E.coli W3110 A 102/pML310/l 37 °C-on 24 órán át 200 f/p-el rázott lombikban tenyésztjük. A táptalaj összetétele a következő 23. példa (g/1): Na2HP0v7H20 9,0 KH2PO4 3,0 NaCl 0,5 CaClz 0,015 MgSO7H20 0,25 vas(lll)-citrát 0,006 MOPS 40 NH4CI 3,5 kazein- hid rolizátum 7,0 élesztökivonat 5,0 cereloz (glükóz) 20 ampicillin 0,1 A közeg pH-értéke 6,54. A tenyésztés alatt 14,9-es optikai sűrűséget (ODhk) érünk el. A sejteket (a szaporító kultúra 50 ml-e) összegyűjtjük és 5 ml 50 mM Tris.HCl (pH =8) és 30 mM NaCl összetételű oldatban újraszuszpendáljuk. Utána a szuszpenziót 5 g hűtött üveggyönggyel (átmérő 0,5 mm) vagy lizozimmal (Boehringer), végkoncentréció 1 mg/ml, 30-45 perc alatt időközönként Multi-Tube Vortexer-rel nagy intenzitással rázzuk. 0,5 ml elegyhez 0,5 ml 2X-os ecetsavat adunk és az elegyet 20 percig 4 °C-on 12 000 f/p-en centrifugáljuk. A felülúszót hiru din-aktivitásra vizsgáljuk (trombingátlás). A trombingátlási tesztet a következőképpen végezzük: A teszt a p-nitro-anilin Chromozym TH (tozil-glicil-prolil-arginin-4- -nitroanilid-acetát) szubsztrátból való enzimatikus kihasításán alapul. A képződött p-nitroanilint 405 nm-es kolorimetriásan mérjük (Micro-Elisa Auto Reader, Dynatech, Kloten). A tesztet simaaljú mikrotitráló lemezekben (Coster, Serocluster, Catalog Nr. 3590) végezzük. A reakcióidő 2 óra 37 °C-on inkubátorban. A tesztet 20 pl meghatározandó oldatot 30 pl töltőpufferrel (0,2 M Tris.HCl pH = 7,5, 1 M NaCl, 100 pg/ml marhaszérumalbumin) hígítunk és 20 pl enzim-oldattal (10 mg liofilizált trombin humán plazmából (Boehringer) 1 ml-ben oldva és a fenti tóltópufferrel kb. 1:400 arányban higitva) és 150 pl szubsztrátoldattal [20 ng Chromozym TH Boehringer)] 4 ml bidesztillált vízben oldva és a fenti töltőpufferrel 1:15 arányban higitva) elegyítünk. Minden oldatot összehasonlító oldattal szemben, amely 70 pl töltőpufferből (ld. f.) és 150 pl szubsztrát-oldatból áll, és enzim-kontrolloldattal szemben, amely 50 pl töltópufferböl, 20 pl enzimoldatból és 150 pl Bzubsztrátoldatból áll, mérünk. Az enzim-kontrolloldat OD405-értéke 2 óra után 37 °C-on 100X aktivitást ad és kb. 0,8 t 0,2 legyen. A minta trombingátlását (X-ban) a képlet szerint számítjuk X-trombin- 100 x OD40S a mintáé gátlás = 100 - — OD40S az enzim-kontrolloldaté A felülúszó trombin-gátlása 49.7X/20 pl. 24. példa Tisztítási eljárás a hirudinvegyületek dúsítására a táplevesből A 22. példában leírttal analóg módon az E.coli W3110 A 102/pML310/l törzset fermentorban tenyésztjük. Utána a sejteket feltárjuk, lecentrifugáljuk és a töményitett felülúszót ecetsavas kezelés után ultraszűrjük vagy dializáljuk. Az ily módon kapott oldatokat például ioncserélő kromatográfiéval tisztíthatjuk. a) Anioncseréló kromatográfia MONO Q oszlopon (Pharmacia) trombint gátló frakciók kinyeréséhez 8,5 ml fehérjeoldatot [20 mM Tris.HCl pH*= 7,5 (150 mM NaCl) a Pharmacia cég kromatográfiás rendszerével (,fa6t protein liquid chromatography" FPLC) Mono Q oszlopra viszünk és a következő feltételek mellett eluáljuk. Kísérleti feltételek: Oszlop: Mono Q, 4,6 mm x 150 ram. A puffer: 20 mM Tris.HCl pH = 7,5; B puffer: 20 mM Tris.HCl/1 M NaCl. Lineáris sógradiens: A: 9 ml alatt 15X B pufferrel eluálni, 10,7 ml folyamán 70X B pufferre növelni. AUFS 1,0 280 nm-en, 1 ml-es frakciók. A kizárási térfogatban (1-10 frakció) egy nagy fehérjecsúcs elválik az utána eluálódó hidrudinvegyületektől. A 17-23 frakciók a trombin tesztben 20-100X közötti trombingátlást mutatnak, mimellett a 92X gátlást mutató főfrakció (20. és 21. frakció) kb. 500 mM NaCl koncentrációnál eluálódik. b) Anioncserélő kromatográfia DEAE cellulóz-oszlopon a hirudinvegyületek dúsítására 10 ml dializátumot anioncserélő kromatográfiának vetünk alá DE 53 (Whatman) oszlopon pH = 7,5-n (kromatográfiás feltételek: oszlop 1x5 cm (10 ml). Az eluáló puffer: 20 mM ammónium-acetát, 100 mM NaCl, pH = = 7,5. B eluáló puffer: 20 mM ammónium-acetát, 1 M NaCl, pH = 4. Lineáris sógradiens 4 oszloptérfogat A illetve B pufferenként. A hirudinvegyületek 0,4 M NaCl koncentrációtól eluálódnak. A kimutatást trombingátlási teszttel végezzük. c) Sómentesités P-6 DG .Desalting gel'-lel (Biorad) 110 ml dializátumot (20 mM Tris.HCl, pH = 7,5, koncentrált fehérjeoldat 2,6 1 felülúszóból) a 24b példában leírt módon DE 53 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 31
