202288. lajstromszámú szabadalom • Eljárás trombin-inhibitorok előállítására
31 HU 202288 B 32 6. R.L. Letsinger and W.B. Lunsford, J. Am. Chem. Soc. 98, 3655 (1976) 7. K. Itakura et al., J. Am. Chem. Soc. 103, 706 (1981) 8. H.G. Khorana et al., J. Bioi. Chem. 251, 565 (1976) 9. S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356 (1982) 10. K. Itakura et al., J. Bioi. Chem. 257, 9226 (1982) 11. A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 560 (1977); siehe auch Meth. Enzym. 65, 499 (1980) 12. A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 1929 (1978) 13. Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741 (1961) 14. M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159 (1970) 15. H.U. Bergmeyer (Hrsgb.), Methods of Enzymatic Analysis, Vol. II, 3. Auflage, S. 314-316, Verlag Chemie, Weinheim (1983). 16. F. Markwardt et al., Thromb. Haemostasis 47, 226 (1982) 17. Köhler und Milstein, Nature 256, 495 (1975) 18. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (ed. T. Maniatis et al.), Cold Spring Harbor Lab., 1982, S. 125 19. W. Muller et al., J. Mol. Biol. 124, 343 (1978) 20. M. Grunstein und D.S. Hogness, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 72, 3961 (1979) 21. Ish-Horowitz, in loc. cit. 18), S. 368 22. DE-OS 3 111 405 (Genentech) 23. A.C. Peacock et al., Biochemistry 6, 1818 (1967) 24. U.K. Laemmli, Nature 227, 680 (1970) 25. P. Walsmann, Pharmazie 36, 860 (1981) 26. J.F. Kearney et al., J. Immunol. 123, 1548 (1979) 27. S. Alkan et al., Mol. Immunol. 20, 203 (1983) 28. T. Chard, An Introduction to Radioimmunoassay and related Techniques, North-Holland Publ. Comp., Amsterdam 1978 29. A.E. Bolton und W.M. Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973) 30. J. Clarke und J. Carbon, J. Mol. Biol. 120, 517 (1978) 31. J.Y. Chang et al., Methods in Enzymology, 91, 41 (1983) 32. D.S. Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193 (1981) 1. példa Védett nukleozid-polisztirolgyanta előállítása 20 ml abszulút piridinben oldott 2,57 g (5 mmól) 5’-(4-metoxi-tritil)-timidint (MMT-0T-0H) 750 mg borostyánkósavanhidriddel és 910 mg 4-dimetil-amino-piridinnel elegyítünk és 16 órán át szobahőmérsékleten állni hagyjuk. A piridines oldat bepárlása után 200 ml etil-acetátban felvesszük, kétszer egyenként 200 ml 0,1 M foszfátpufferrel, 10 ml teli tett konyhasó-oldat hozzáadása közben kirázzuk, mégegyszer mossuk telített konyhasó oldattal, szárítjuk, bepároljuk és hexánt csepegtetünk hozzá. A kivált terméket elválasztjuk és kétszer éterrel eldörzsöljük, majd 300 ml etil-acetátban oldjuk és 0 °C-on 180 ml pH = 2,5-ös 0,1 M kálium-hidrogén-szulfáttal kirázzuk. Kétszeri vizes mosás utána az etil-acetátos oldatot nátrium-szulfáton szárítjuk, szűrjük, 0,5 ml piridinnel elegyítjük, bepároljuk és cseppenként hexánnal hígítjuk. A kivált borostyánkösav-származékot leszűrjük. Ebből a vegyületből 1,0 g-ot 190 mg N-hidroxi-szukcinimiddel együtt 4 ml etil-acetátban és 2 ml dimetil-formamidban oldunk és 0 °C-on 370 mg N,N’-diciklohexil-karbodiimiddel elegyítjük. Egy éjszakán át hűtőszekrényben való állás után a kivált N,N’-diciklohexil-karbamidot leszűrjük, a szűrletet etil-acetáttal hígítjuk, hideg 0,1 M nátrium-hidrogén-karbonáttal és vízzel extraháljuk, szárítjuk és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot etil-acetáttal kovasavgélen kromatografáljuk. VRK: Rt = 0,45 diklór-metán:metanol (9:1) elegyben. Ebből az N-szukcinimidoil-borostyánkósav-észterből 100 mg-ot 1 g amino-metil-polisztirollal (amintartalom 110 umól/g) 2 ml diklór-raetán és 4 ml dimetil-formamid elegyében 20 órán át keverünk. A polimer gyantát leszűrjük és dimetil-formamiddal, metanollal, diklór-metánnal és metanollal kimossuk. Szárítás után a nem reagált aminocsoportokat acilezzük oly módon, hogy a gyantát 6 ml piridinben 1 ml ecetsavanhidriddel és 100 mg 4-dimetil-amino-piridinnel 30 percen át keverjük. A polimer gyantát diklór-metánnal, dimetil-formamiddal, metanollal és diklór-metánnal kimossuk és súlyállandóságig szárítjuk. A spektroszkópiai metoxi-tritil(MMT)-meghatározás 57 pmól/g töltöttséget ad. 2. példa Az 1. példával analóg módon állítjuk elő a következő védett nukleozid-polisztirolgyantát: 5’-(4-metoxi-tiritil)-N-izobutiril-dezoxi-guazozinból, töltöttség 32 umól/g. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 18
