202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B egy ATG transzlációs startszignál és egy transzlációs stopszignált is tartalmazzon. Az ilyen gén elkülönítésének és megszerkesztésének a módját az alábbiak során ismertetjük. A negyedik komponens egy élesztő DNSszekvencia, amely egy oly élesztőgén 3’-szegélyező szekvenciáját tartalmazza, amelyben megfelelő szignálok vannak jelen a transzkripció befejezésére és a poliadenilezésre. Mindezeknek a komponenseknek a jelenlétében vált lehetségessé immun interferon élesztőben történő termeltetése. 3. Expresszió emlősállat-sejtkultúrában Az immuninterferon emlősállat-sejtkultúrában történő szintézisének stratégiája egy olyan vektor kifejlesztésén alapul, amely képes mind az antonóm replikádéra, mind pedig egy idegen génnek egy heterológ transzkripciós egység irányítása alatti expressziójára. E vektornak a szövetkultúrában történő replikációját Oly módon értük el, hogy gondoskodtunk egy SV40 vírusbői szárazó DNS-replikációs kezdőpontról, emellett egy segítő funkciót (T-antigén) is létrehozunk a vektornak egy az antigént endogén módon kifejező sejtvonalban való bevezetése útján (28, 29). Az SV40 vírus késői promotere megelőzte az interferon szerkezeti génjét és biztosította a gén transzkripcióját. Az IFN-y expressziójának lefolytatására alkalmazott vektor pBR322 szekvenciákból állt, amelyek egy szelektálható jelzőt (marker) nyújtottak az E. coliban történő szelekcióhoz (ampicillin-rezisztencia), valamint egy E. coli kezdőpontját a DNS-replikációhoz. Ezeket a szekvenciákat a pML-1 plazmidból (28) nyertük; ezek átfogták az EcoRI és BamHI resztrikciós helyeket magukban foglaló tartományt. Az SV40-kezdőpontot egy 342 bázis-párt tartalmazó és ezt a tartományt átfogó PvuII-Hindin fragmensből (30, 31) nyertük (amelynek mindkét vége EcoRI végződéssé volt átalakítva). Ezek a szekvenciák, amellett hogy tartalmazzák a DNS-replikáció vírus-kezdőpontját, egyúttal kódolják mind a korai, mind a késői transzkripciós egység promoterjét is. Az SV40 kezdőpont tartományának orientációja olyan volt, hogy az interferont kódoló génnel a késői transzkripciós egység promotere volt szomszédos helyzetben. A rajzok rövid ismertetése Az 1. ábra az indukált perifériális vér-limfocita (PBL) poli(A)+RNS szacharóz-grádienses centrifugálását szemlélteti. Az interferon-aktivitásnak két csúcsértéke volt megfigylehető vonalkázott oszlopokkal ábrázolva). 12S és 16S mérettel. A (fentiektől függetlenül centrifugált) riboszómás RNS-jelzők helyzetét az abszorbancia-profil felett jeleztük. A 2. ábra az indukált PBL poli(A)+RNS savas karbamid-agarózon keresztüli elektroforézisét szemlélteti. Csak egy aktivitás- csúcsérték volt megfigyelhető, amely 18S RNS-sel migrált együtt. A szomszédos sávban vizsgált és etidium-bromidos festéssel láthatóvá tett riboszómás RNS-jelzők helyzetét az aktivitás- profil felett jeleztük. A 3. ábra 96 kolónia indukált és indukálatlan 32P-jelzett cDNS-próbával kapott hibridizációs képét szemlélteti. 96 egyedi transzformánst szaporítottunk egy mikrotiter-lemezen, a replikátumot két nitrocellulóz-membránon terítettük, majd a szűrőket vagy indukált mRNS-ből (felső kép), vagy indukálatlan PBL-kultúrákból elkülönített mRNS-ből (alsó kép) kapott 32P-jelzett cDNS próbákkal hibridizáltuk. A szűrőket azután a nemhibridizált RNS eltávolítása céljából mostuk, majd röntgenfilmre helyeztük. Ezek a szűrőcsoportok 8300 független kolóniát tartalmazó 86 ilyen szűrőcsoport reprezentáns képviselőjének tekinthetők. Az „indukált” kiónok egyik például szolágló képviselőjét „H12”-ként jelöltük az ábrán. A 4. ábra a 69-es klón cDNS inszertumának restrikciós endonukleáz „térképe”. A cDNS inszertum PstI helyek (pontok a két végen) és oligo dC-dG farkak (egyszerű vonalak) által van kötve. A resztrikciós nukleázzal végzett hasítás útján kapott fragmensek számát és méretét 5%-os akrilamid-gélen keresztül történő elektroforézis alapján becsültük. Az egyes helyek helyzetét (lásd 5. ábra) nukleinsav-szekvenálás útján azonosítottuk. A legnagyobb nyílt leolvasó fázis kódolási tartományát bekeretezve ábrázoltuk; a vonalkázott tartomány mutatja a feltételezett 20 maradék-szignál peptid-szekvenciát, míg a pontozott szakasz az érett IIF szekvenciát (146 aminosav) képviseli. Az mRNS 5’-vége balra, a 3’-vég pedig jobbra van. Az 5. ábra a p69 plazmid cDNS inszertumának nukleotid- szekvenciáját szemlélteti, az IFN-y leggyakoribb allél-alakját mutatva. Látható a leghoszszabb nyílt leolvasófázis levezetett aminosavszekvenciája is. A feltételezett szignál-szekvenciát az „SÍ” és „S20” jelek közötti maradékok képviselik. A 6. ábra az IFN-y mRNS szerkezetének a leukocita (IFN-a) és fibroblaszt (IFN-ß) interferon szekezetével való összehasonlítását mutatja. Az „Immun” jelzésű 69-es klón mRNS-e szignifikánsan nagyobb menynyiségben tartalmaz „lefordítatlan” szekvenciákat. A 7. ábra az IFN-y expressziós plazmidjának a pEFN-y trp48 felépítésének vázlatos diagrammja. Kiindulási anyag a p69 plazmidból származó 1250 bázispárt tartalmazó PstI cDNA. A 8. ábra az IFN-y majom-sejtekben történő expressziójára alkalmazott plazmid diagrammja. A 9. ábra nyolc különböző, EcoRI enzimmel kezelt humán genom DNS-nek a p69 plazmid tyha cDNS inszertumából származó, 32P-jelzett, 600 bázispárt tartalmazó DdeI fragmemsével történő Southem-féle hibridizációját szemlélteti. Két EcoRI fragmens tisztán hibridizál a próbával mindegyik DNS-mintában. A 10. ábra nyolc különböző resztrikciós endonukleázzal kezelt humán genomikus DNS-ének a p69 plazmidból származó 32P- jelzett szondával történő Southem-féle hibridizációját mutatja. All. ábra a pBl vektor 3.1 kbp HindlU inszertum (amelyből a PGK promoter elkülönítése történt) restrikciós térképét mutatja. Látható egy EcoRI helynek és egy Xbal helynek a PGK gén 5’-szegélyező DNS-ébe való beiktatása. A 12. ábra az 5’-szegélyező szekvenciát és a PGK gén kezdeti kódoló szekvenciáját mutatja az Xbal és EcoRI helyek beiktatása előtt. A 13. ábra egy Xbal helynek a PGK promoter 8-helyzetébe történő beiktatására, valamint az említett Xbal-véget és egy Sau3A véget tartalmazó PGK-5’szegélyező szekvencia 39bp fragmentjének elkülönítésére alkalmazott eljárást szemlélteti vázlatosan. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
