202287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás humán immun interferon és ezt tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202287 B 2 szekvenciájú, humán gamma- vagy immuninterferon polipeptidet kódoló DNS szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy a) emberi szövetből mRNS-t nyerünk ki, ebből az mRNS-ből cDNS könyvtárat készítünk, ezt megfelelő plazmidba iktatva, és ezt a plazmidot valamely baktériumba, előnyösen E. coli-ba transzformálva transzformánsokat készítünk, a transzformánsokat radioaktív vizsgáló mintával (próbával) átvizsgáljuk, a hibridizáló telepekből plazmidokat készítünk, ezek cDNS-ének szerkezetét megvizsgáljuk, és a tárgyi kör szerinti szerkezetnek megfelelő polipeptidet kódoló plazmidot, előnyösen a p69 plazmidot kiválasztjuk, és ebből a humán immuninterferont kódoló DNS szakaszt elkülönítjük, vagy b) a tárgyi körben megadott aminosav-szekvenciának megfelelő DNS szakaszt vegyi úton szintetizáljuk. 3. Eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó vektor előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 2. igénypont szerinti DNS szakaszt a megfelelő szabályozó rendszerrel rendelkező vektorba iktatjuk. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás a humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó, E. coliban replikálódni képes pIFN-y trp48 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy p69 plazmidot Pstl-gyel és BstNI-gyel emésztünk, az N-terminális első 5 aminosavát kódoló DNS-en belül a DNS szekvenciát elhasítjuk, majd szintetikus DNS-t építünk az N-terminális végre olyan módon, hogy az eredeti N-terminálist kódoló vég helyreálljon, és ezen kívül még egy MET kód is legyen az N-terminális végén, és az így kapott plazmidot EcoRI-gyel és Pstl-gyel hasított pLEEF A trp 103 plazmidba építjük, és a pIFN-y trp48 plazmidot kinyerjük. 5. A 3. igénypont szerinti eljárás a humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó, élesztőben replikálódni képes pPGK-IFN-y plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy IFN-y trp48 plazmidot, EcoRI-gyel emésztett pFRM31 plazmidot és Clal-gyel, valamint EcoRI-gyel emésztett pPGK-1500 plazmidot ligálunk, és a pPGK-IFN-y plazmidot kinyerjük. 6. A 3. igénypont szerinti eljárás a humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó, állati szövettenyészetben replikálódni képes pSV 69 plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy SV40 origót magában foglaló EcoRI restrikciós fragmentumot pML-1 plazmidba iktatjuk, az így létrejött plazmidba HBV bázispárokat tartalmazó fragmentumot iktatunk, az így létrejött plazmidban p69 plazmidból eredő IFN-y-gént iktatunk, és így a pSV 69 plazmidot nyerjük. 7. Eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns E. coli vagy élesztő törzs, vagy állati szövettenyészet előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 3. igénypont szerinti vektort E. coli, vagy élesztő törzsbe, vagy állati szövetsejtbe transzformálunk. 8. A 7. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypotban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns E. coli törzs előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely E. coli törzset a 4. igénypont szerinti pIFN-y-trp48 plazmiddal transzformálunk. 9. A 7. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns élesztőtörzs előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely élesztőtörzset az 5. igénypont szerinti pPGK-IFN plazmiddal transzformálunk. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferont kódoló DNS szekvenciát tartalmazó transzformáns állati szövetsejt előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely állati szövetsejtet a 6. igénypont szerinti pSV 69 plazmiddal transzformálunk. 11. Eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciájú humán immuninterferon, illetve N-terminálisán CYS-TYR-CYS aminosavszekvenciát nélkülöző származéka előállítására, azzal jellemezve, hogy a 7-10. igénypontok bármelyike szerinti transzformáns E. coli vagy élesztősejtet vagy állati szövetsejtet megfelelő tápközegben tenyésztjük, és a tenyészetből transzformáns E. coli és élesztősejtek tenyésztése eseténben a 2. igénypontban megadott szekvenciájú polipeptidet, illetve az állati szövetsejtek tenyésztése esetében ennek CYS-TYR-CYS aminosavszekvenciát nélkülöző származékát kinyerjük. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás a 2. igénypontban megadott szekvenciának N-terminálisán CYSTYR-CYS amianosavszekvenciát nélkülöző származékát jelentő humán gamma interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 7. vagy 10. igénypont szerinti transzformáns állati szövetsejtet megfelelő tápközegben tenyésztünk, és a tárgyi körben jellemzett szekvenciájú humán gamma interferont kinyerjük. 13. Eljárás a rekombináns humán gamma interferont tartalmazó immun-szabályozó gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1., 11. és 12. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns humán gamma interferont gyógyászatiig elfogadható segédanyagokkal gyógyászati készítménnyé keverjük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 17
