202286. lajstromszámú szabadalom • Eljárás egy új antibiotikum, az aranorozin és a vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202286 B 2 A találmány tárgya eljárás egy új antibiotikum, az aranorozin és a vegyületet tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. Az új antibiotikum előállítását a Y-30499 számú gombatenyészetből végezzük. Az aranorozin előállítására szolgáló Y-30499 számú gombatenyészetet a talajból izolálták és Pseudoarachniotus roseus Kuehn-ként azonosították [Mycologia 69, 126-163 (1977)], amely a Gymnoascaceae családhoz, Eurotiales rendhez, Plectomycetes osztályhoz, Ascomycotina altörzshöz és Eumyxota törzshöz tartozik (G. C. Ainsworth, F. K. Sparrow és A. S. Sussman 1973, „The Fungi, An Advanced Treatise” IVA és IVB kötet, Academic Press, New York). Az irodalomból nem ismeretes olyan antibiotikum, amelyet ez a gombatenyészet állít elő. Az Y-30499 számú tenyészetet 1987. június 23-án Göttingenben a „Deutsche Sammlung von Mikroorganismen”-nál DSM 4151 számon helyeztük letétbe. Az aranorozin szerkezete a (I) képlettel ábrázolható. A találmány szerinti eljárást az új antibiotikum, az aranorozin előállítására Y-30499 számú gombatenyészetből előnyösen úgy végezzük, hogy ezt a gombatenyészetet fermentációval aerob körülmények között olyan táptalajon, amely szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen tápsókat és nyomelemeket tartalmaz, 24 és 30 °C közötti hőmérsékleten, 6,0 és 8,0 közötti pH-nál, 66-90 órán keresztül tenyésztjük, majd az antibiotikumot a tápközegből a szokásos módon izoláljuk és tisztítjuk. Szénforrások közül megemlítjük a glükózt, nádcukrot, keményítőt és a dextrint. Ezek közül előnyös a keményítő alkalmazása. A nitrogénforrások közül példaként megemlítjük a szójalisztet, a triptont, a keményítőkivoantot, a marhahús kivonatot, a maláta kivonatot, a kukorica áztatóvizet, a pepton vagy szervetlen anyagokat, például ammóniumsókat. A nitrogénforrások közül előnyös a szójaliszt alkalmazása. A szervetlen tápsók közül megemlítjük a nátriumkloridot, a kálium-hidrogénfoszfátot, a kálium-dihidrogénfoszfátot és a kalcium-karbonátot. Nyomelemek közül vassók, mangánsók, rézsók, timsók és kobaltsók jönnek számításba. Az Y-30499 számú kultúra tenyésztését előnyösen 26 °C-on (+1 °C) és pH=6,5-nél végezzük. A tenyésztést mind rázólombikban, mind fermentorban elvégezhetjük. A tenyésztés időtartama előnyösen 72 óra. Ez az az időtartam, amelynél a találmány szerint előállított antibiotikum a legnagyobb kitermeléssel nyerhető ki. A tenyésztést előnyösen a merüléses módszerrel végezzük. Amennyiben a gombatenyészet tenyésztését feimentorban végezzük, akkor adott esetben habzásgátlót, célszerűen propilén-oxid alapú lineáris poliétert, előnyösen 2000+100 molekulatömegű poliétert (például a Bayer cég Desmophen nevű termékét) is alkalmazhatunk. A találmány szerint előállított aranorozin képződésének előrehaladását a tenyészet bioaktivitásának mérésével határozhatjuk meg Bacillus subtilis és Aspergillus niger-rel szemben, az ismert agarlemez-diffúziós meghatározási módszerrel. A találmány szerinti eljárással előállított aranorozint a szokásos ismert laboratóriumi eljárásokkal izoláljuk a tápközegből és tisztítjuk. A micéliumot a tenyésztőoldatból célszerűen a tápközeg centrifúgálásával választjuk el. Az aranorozin a szűrletből extrakcióval nyerhető ki, ehhez egy vízzel nem elegyedő oldószert használhatunk, célszerűen etil-acetátot, kloroformot vagy butanolt, miután a szűrlet pH-ját 7,0-ra állítjuk be. Az extrahálószerek közül előnyösen etil-acetátot alkalmazunk. A micéliumban lévő aranorozint úgy nyerjük ki, hogy a micéliumot oldószerrel, célszerűen etil-acetáttal, kloroformmal, etanollal, metanollal, acetonnal vagy butanollal extraháljuk. Oldószerként előnyösen acetont alkalmazunk. Az extrakció után az oldószert vákuumban ledesztilláljuk, a vizes réteget vízzel hígítjuk és ismét a fent említett oldószerek valamelyikével extrahálunk. A szűrletből és a micéliumból extrahált oldatokat egyesítjük, szárazra pároljuk, majd tisztítjuk célszerűen oszlopkromatográfiás módszerrel. A következőkben példákkal is illusztráljuk a találmányt. 1. példa 499 törzskultúra: Y-3 Y-30499 tenyészetet Sabouraud-féle glükóz-agartápközegen tenyésztjük, amelynek összetétele a következő: glükóz 40 g pepton 10 g Na2HP04 1 g agar 15 g desztillált víz 1 1 pH 6,5 Az alkotórészeket melegítéssel teljesen feloldjuk, majd a tápközeget kémcsövekbe szétosztjuk, és 20 percig 121 °C-on sterilizáljuk. A pH az autoklávozás előtt 6,5. A kémcsöveket a ferde agar előállításához ferde állásban lehűtjük. A ferde agart a talajból izolált Y-30499 kultúra spóráival beoltjuk és 26 °C-on (±1 °C) inkubáljuk, amíg a jó spóraképződés megfigyelhetővé válik. A jól kialakult spórákkal a tenyészetet hűtőszekrényben tároljuk. Y-30499 tenyésztése rázólombikba az új antibiotikum az aranorozin fermentációs előállításához: Az oltótenyészet összetétele: oldható keményítő 15 g szójaliszt 15 g glükóz 5 g CaC03 2 g NaCl 5 g élesztőkivonat 2 g kukorica áztatóvíz 1 g desztillált víz 1 1 Ebből az oltáshoz való tápközegből szélesnyakú, 500 ml-es Erlenmeyer lombikba 100 ml-eket adagolunk, és azokat 121 °C-on 20 percig sterilizáljuk. A pH értéket az autoklávba való bevitel előtt 6,5-re állítjuk be, és ez az autoklávból való kivétel után 6,0. A lombikokat ezután lehűtjük, és néhány platinakacsnyi fent említett jó spóraképződésű kultúrával beoltjuk, majd 60 órán keresztül 240/perc sebességgel 26 °C-on (±1 °C) rázzuk, és így jó növekedést figyelhetünk meg. Az így kapott oltótenyészetet hasz5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
