202285. lajstromszámú szabadalom • Eljárás L-treonin előállítására fermentálással
1 HU 202285 B 2 rid, vas(II)-szulfát, mangán-szulfát, réz-szulfát, kalcium-karbonát, stb. A tenyésztést aerob körülmények között végezzük rázott tenyészettel vagy kevert merülő tenyészettel vagy hasonló módon, 20-40 *C, előnyösen 28- 38 *C hőmérsékleten. A táptalaj pH-értéke 5-9, előnyösen semleges körüli érték. A pH-értékét kalciumkarbonáttal, szervetlen vagy szerves savakkal, alkáliaoldatokkal, ammóniával, pH puffer-oldatokkal vagy hasonlókkal állítjuk be. Az L-treonin a tenyészetben 2-7 tenyésztési nap után szaporodik fel. A tenyésztés befejezése után a csapadékot, így a sejteket, stb. a tenyészetből centrifugálással eltávolítjuk, és az L-treonint a tenyészetből ioncserélő kezelés, koncentrálás, kisózás vagy hasonlók együttes alkalmazásával kivonjuk. A találmány szerinti eljárás kiviteli módját a példákkal szemléltetjük. 1. példa Az L-treonin-termelési tesztet oltótörzsként Escherichia coli H-4581 (FERM BP-1411) törzset használva végezzük. A H-4581 törzset rázással, 30 ‘C-on 16 órán át tenyésztjük oltótáptalajban (pH-7,4), amely 2% glükózt, 1% peptont, 1% élesztőkivonatot, 0,25 NaCl-t és 0,1 g/liter diamino-pimelinsavat tartalmaz. Az így kapott oltótenyészet 100 ml-ét átoltjuk egy 2 literes kis fermentorba, amely 1 liter alábbi fermentációs táptalajt tartalmaz, és 30 ‘C-on 700 fordulat/perc keveréssel és 1 térf./perc levegőztetéssel 80 órán át tenyésztjük, miközben - ha szükséges - a fermentációs táptalajhoz 60% glükózt adagolunk és a pH-értékét a tenyésztés alatt vizes ammónia-oldattal 6,5-re beállítjuk. Az L-treonin 70,5 g/1 mennyiségben képződik. Ha az eredeti H-4257 törzset (FERM BP-984) kontrollként hasonló módon tenyésztjük, akkor az L-treonin 48,1 g/liter mennyiségben képződik. A fermentációs táptalaj összetétele a következő: glükóz 3% (NH4)2S04 1,2% KH2P04 0,3% MgS04.7H20 0,02% diamino-pimelinsav 0,6 g/liter DL-metionin 0,1 g/liter kukoricalekvár 1,2% Ezután a H-4581 törzs alkalmazásával kapott, L- treonint tartalmazó 1 liter fermentlét a sejtek és más szennyezések eltávolítása céljából 10 percig centrifugáljuk (3000 fordulat/perc). Az így kapott felülúszót erősen savas ioncserélő gyantán (Diaion SK I, H+ típus, Mitsubishi Kaséi Corporation, Japán) átengedjük, ez az L-treonint adszorbeálja. Az oszlopot vízzel mossuk, majd 0,5 n vizes ammónia-oldattal eluálva, L-treonin frakciókat szedünk. A frakciókat koncentráljuk és a maradékhoz etanolt adunk. A keveréket hűtve tároljuk, így 48,9 g L-treonint kapunk kristályos alakban, tisztasági foka 98% vagy nagyobb. 2. példa A H-4581 törzset, amit oltótörzsként használunk, rázással tenyésztjük 30 °C-on, 16 órán át oltótáptalajban (pH-7,4), amely 2% glükózt, 1% peptont, 1% élesztőkivonatot, 0,25% NaCl-ot és 0,1 g/liter diamino-pimelinsavat tartalmaz. Ezután az így előállított oltótenyészet 2 ml-ét átoltjuk 250 ml-es Erlenmeyer lombikban lévő 20 ml fenti fermentációs táptalajba és rázással, 30 ‘C-on 72 órán át tenyésztjük. Az L-treonin 22,1 g/liter mennyiségben képződik. Ha az eredeti H-4257 törzset kontrollként hasonló módon tenyésztjük, akkor az L-treonin 17,2 g/liter mennyiségben képződik. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy az alkalmazott mutáns törzs tenyésztésével 25-30%-kal több L-treonin képződik, mint amennyi az ismert törzs tenyésztése során termelődik. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás L-treonin előállítására fermentálással, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli fajhoz tatozó, rifampicinre, lizinre, metioninra, aszparaginsavra és homoszerinre rezisztens, L-treonint termelni képes mikroorganizmust táptalajban tenyésztjük, míg az L-treonin a tenyészetben felszaporodik, majd az L-treonint a tenyészetből kivonjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az Escherichia coli H-4581 (FERM BP-1411) mikroorganizmus segítségével fermentálunk. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 20-40 °C-on 2-7 napig, 5-9 pH-értéken végezzük. 5 10 15 20 25 30 35 40 45
