202283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás karbonsavészterek előállítására enzimreakció útján
1 HU 202283 B 2 Az olvadáspont, optikai forgatóképesség, elemanalízis és molekuláris extinkciós együttható alapján az így kapott vegyületek azonosnak bizonyultak a Journal of Antibiotics 26, 647 (1973) irodalmi helyen leírt megfelelő vegyületekkel. 8. példa: Etil-acetát előállítása Keverővei ellátott 10 literes üvegbélésű reaktorba 1 mól etanolt tartalmazó 20 liter metil-izobutil-ketont helyezünk, és az oldat hőmérsékletét 37 °C-on tartjuk, majd hozzáadjuk a 2. referencia- példa szerint előállított, PEG-gel módosított észteráz 300 ml térfogatú oldatát 0,2 M trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-maleinsav pufferoldatban (pH 7,0), amelyben a PEG-gel módosított ézsterázkoncentrációja 12 mg/ml. Ezután az elegyhez a 4. táblázatban feltüntetett koncentrációban ecetsavat adunk, és utána az elegyet 37 °C-on 20 percig keverjük. A metil-izobutil-ketonos réteget ejkülönítjük, és az alábbi körülmények megtartásával gázkromatográfiás (GC) elemzésnek vetjük alá. A gázkromatográfiás elemzés körülményei az alábbiak: Készülék: GC-9A típus, Shimazu Corporation, Japán Oszlop: Porapak P (60-80 mesh finomságú, átmérője 3 mm, hosszúsága 2 m, Waters Co., USA) Detektor: FID típus (Shimazu Corporation, Japán) A hidrogén nyomása: 50 kPa A légnyomás: 50 kPa A hidrogén áramlási sebessége: 35 ml/perc A levegő áramlási sebessége: 480 ml/perc Az oszlop hőmérséklete: 140 °C Az injektor és detektor hőmérséklete: 150 °C A minta térfogata: 5 pl A komponensek retenciós ideje a következő: Etil-acetát (termék): 4,1 perc Etanol: 1,3 perc Ecetsav: 2,6 perc Metil-izobutil-keton: 6,0 perc Valamennyi komponenst meghatároztuk különleges minőségű vegyszereket (Wako Pure Chem. Ltd., Japán) használva autentikus mintákként. Az eredményeket a 4. táblázatban tüntettük fel. 4. táblázat Ecetsavanhidrid Kezdeti koncentráció az oldószerben mM Etil-acetát Kialakuló koncentráció az oldószerben mM Ecetsav Kialakuló koncentráció az oldószerben mM 0 0 0 2,5 2,4 2,5 5,0 5,2 4,9 10 9,8 8,2 15 15,2 12,3 20 19,3 18,3 30 24,0 23,8 40 25,1 24,5 50 26,2 25,1 9. példa: Etil-acetát elkülönítése A 8. példában bemutatott 4. táblázatban az ecetsavanhidrid koncentrációját 30 mM-nek véve a képződött etil-acetátot az alábbiakban leírt eljárás szerint elkülönítjük. A reakcióelegyhez 5 liter desztillált vizet adunk, alaposan átkeverjük, majd 10 literes választótölcsérbe visszük. Egy órás állás után a vizes fázist elkülönítjük, a szerves fázishoz 500 ml 2%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldatot adunk, és a választótölcsérben alaposan átkeverjük. Egy órás állás után a vizes fázist elkülönítjük, és a szerves fázishoz 5 liter desztillált vizet adunk. A fentebb leírt módon elkülönítjük a vizes réteget. Az így kapott elegyet a fentiekben leírt módon háromszor mossuk vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldattal az enzimfehérje, etanol és ecetsav eltávolítása céljából. Ezután további 5 liter desztillált vízzel mossuk, majd az elegyet atmoszféranyomáson desztilláló kolonnával 77 °C hőmérsékleten desztilláljuk, és így etil-acetátot kapunk. A termék sűrűsége 20 °C-on, törésmutatója és a kapott vegyület forráspontja azt mutatja, hogy azonos a Merck Index 8. kiadásában (1968) leírt termékkel. 10. példa: Etil-acetát előállítása módosított észterázzal 2,4-bisz(0-metoxi-polietilénglikol)-6-klór-s-triazin alkalmazásával olyan PEG-gel módosított karboxilészteráz enzimet állítunk elő (Enzyime Nomenclature, 3.1.1.1) (a Sigma Co., USA terméke), amely sertésmájból származik. A 2. referencia-példában leírt eljárást követjük. PEG-gel módosított észteráz alkalmazásával a 8. példában leírt eljárást követve ecetsavanhidridet etanollal reagáltatunk, és az így kapott etil-acetátot és ecetsavat a 8. példában leírt kvantitatív elemző módszer segítségével mérjük. Az eredményeket az 5. táblázatban foglaltuk össze. 5. táblázat Ecetsavanhidrid Kezdeti koncentráció az oldószerben mM Etil-acetát Kialakuló koncentráció az oldószerben mM Ecetsav Kialakuló koncentráció az oldószerben mM 0 0 0 2,5 2,4 2,6 5,0 5,0 4,9 10 9,5 8,3 15 14,9 13,0 20 18,5 17,8 30 23,5 22,9 40 24,0 24,1 50 25,9 25,0 11. példa: Etil-acetát elkülönítése Ha a 10. példa 5. táblázatában megadott ecetsavanhidrid kezdeti koncentrációja 30 mM, akkor az etil-acetátot a 9. példában leírt módon elkülönítve 3,05 g etil-acetátot kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
