202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 Az összes ilyen szekvencia jellemzett, és szintetikusan előállítható vagy ismert plazmidokból izolálható. A plazmid replikációt egy példaként említett kivitelezési változatban egy hőindukálható runaway replikon határozza meg [1 557 774 számú birt szabadalmi leírás és Uhlin és munkatársai, Gene, 6, 91 (1979)]. 30 °C alatti hőmérsékleten, előnyösen 25 °C hőmérsékleten a replikon alacsony kópiaszámot biztosít, sejtenként 10—15-öt. Ha a hőmérsékletet 37 °C-ra növeljük, úgy a másolatok számát szabályozó rendszer nem működik, és a replikont tartalmazó plazmidok száma sejtenként 1000-2000-re nő. Az itt példaként említett runaway (elveszthető) replikont az előzőekben ismertetett pIM-I’-A3 kiindulási plazmid tartalmazza. A témában jártas szakember érti, hogy a jelen leírás nem korlátozódik egy adott ilyen típusú replikon vagy másolat mutáns használatára. Más indukálható „elveszthető” vagy nagyszámú másolatot biztosító replikonok állíthatók elő megfelelő szelekcióval, vagy W082/02901 közzétételi irat szerint eljárva. Ezeket a replikonokat felhasználhatjuk olyan expressziós vektorok előállítására, amelyek a jelen találmány oltalmi köréhez tartoznak. Ilyen „elveszthető” replikonokat hordozó vektorokba idegen géneket klónozva olyan termékhez jutunk, amely indukciókor elveszti a másolatok számát szabályozó rendszert, és nagymértékben fokozódik az adott protein szintézise, így ez idáig ismeretlen és fel nem fedezett intracelluláris proteinszemcsék jönnek létre. Ezek a szemcsék, amelyek egyébként a találmány szerinti eljárást jellemzik, igen homogének protein-összetételük szempontjából, és így megkülönböztethetők az ismert, nagymolekulasúlyú aggregátumoktól, amelyek időnként előfordulnak a rekombináns dezoxi-ribonukleinsavat hordozó gazdasejtekben. Ezek a sejtben jelenlevő aggregátumok heterogének, és gyakran sejtet felépítő komponenseket, például nukleinsavakat, szénhidrátokat, lipideket és peptideket tartalmaznak, az adott protein terméket mindössze 10-20%-ban tartalmazzák. A találmány szerinti granulátumok igen homogének, az előállítani szándékozott protein termékek legalább 50, gyakran 80%-ot meghaladó mennyiségben tartalmazzák. A találmány révén előállítható szemcsés termék könnyen izolálható a sejt lizátumából, és stabil, ha kiskoncentrációjú karbamidos vagy detergenst tartalmazó oldattal mossuk. Mosáskor eltávolíthatók a szemcséhez nem specifikusan kötődő proteinek. Izoláláskor igen specifikus aktív anyagot kapunk, ekkor lényegesen tisztul az idegen protein. Az összes további tisztítási lépés így egyszerű. Különösen előnyös az a tény, hogy a granulátumokból a sejtfal komponensei könnyen elkülöníthetők. Úgy gondoljuk, hogy a találmány szerinti szemcsés anyag képződésekor az idegen protein nem zavarja a sejt normális metabolizmusát, és nem következik be a még nem érett sejt halála. Egyes proteinek, például a humán proinzulin E. coli sejtekben gyorsan degradálódik, és nem halmozódik fel. Azonban, ha ilyen proteineket a találmány szerinti, „elveszthető” replikont tartalmazó vektorokkal fejezzük ki, úgy a proinzulin fehérje oldhatatlan granulátumot képez, és ebben az alakban nem következik be az egyébként labilis protein proteolitikus degradációja. A találmány szerinti granulátumok így nem csupán labilis proteinek felhalmozására alkalmasak, de egyszerűbbé teszik az izolálást és a tisztítást a különböző gének által meghatározott termékek esetén. Ahogy azt az előzőekben megadtuk, bármely aktiválható vagy indukálható replikon és transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvencia, továbbá gyakorlatilag bármely, funkcionált polipeptidet meghatározó nukleotid szekvencia vagy fuzionált génterméket leíró gén felhasználható a fentiekben meghatározott módszer szerint használt vektorok előállítására. Ilyen kódoló szekvencia például, nem limitálóan, a szarvasmarha növekedési hormont (bGH), a humán növekedési hormont (hGH), a humán pre-növekedési hormont (pre-hGH), a sertés növekedési hormont (pGH), emlős növekedési hormont, madár növekedési hormont, növekedési hormon releasing faktort, a humán inzulin A-láncát, a humán inzulin B-láncát, a humán proinzulint, a humán pre-proinzulint, humán és nem humán interferont, urokinázt, szöveti plazminogén aktivátort, interleukin II-t vagy bármely polipeptid hormont, polipeptid enzimet és bármely kutatási vagy gyakorlati értékkel rendelkező, biológiailag aktív polipeptidet kódoló szekvencia. A fenti módon tenyésztett transzformált sejtek, amelyek a granulátumot halmozzák fel például, nem limitálóan, a következők lehetnek: E. coli K12 RV308/pCZ1920, E. coli K12 RV308/pJRl, E. coli K12 RV308/pASPl, E. coli K12 RV308/pCZ112, E. coli K12 RV308/pASP2, E. coli K12 RV308/pATl, E. coli K12 RV308/pAT2, E. coli .KI 2 RV308/pCZ154, E. coli KL2 RV308/pCZ156, Ercoli K12 RV308/pJR1.3, E. coli K12 RV308/pASPL3, E. coli K12 RV308/pASP2.3, E. coli K12 RV308/pAT1.3, E. coli K12 RV308/pAT2.3, E. coli K12 RV308/pCZ154.3 és E. coli K12 RV308/pCZ156.3. A találmány szerinti, szemléltető jelleggel bemutatott dezoxi- ribonukleinsav szekvenciák és plazmidok számtalan módosítása képzelhető el. így például a genetikai kód degeneráltsága miatt lehetséges a polipeptidet meghatározó régiók nukleotidjainak, továbbá például a TAG vagy TGA transzlációs .stop jeleknek a helyettesítése, III III ACT ACT ez utóbbiak esetén például TAA transzlációs stop jelre. I I I ATT A fentiekben R betűvel jelzett rész bármely olyan dezoxi- ribonukleinsav szekvencia lehet, amely a (9) leucin-191 (fenil-alanin) aminosavakat határozza meg a bGH molekulában. Ezeket a szekvenciákat az ismert bGH aminosav szekvenciából meghatározhatjuk, és ezután ismert szintetikus módszerekkel előállíthatjuk. Ugyanakkor ügyelnünk kell arra, hogy a nukleotid tripleteket úgy válasszuk meg, hogy azok megfeleljenek az ismert alapkövetelményeknek és extrapolálásoknak, amelyeket Zuker és Stiegler adott meg [Nucleic Acids Research, 9(1), 133 (1981)], tudniillik, hogy elkerüljük a hírvivő ribonukleinsavban komplementer bázisok képződését. Ilyen komplementer bázisok között létrejövő hidrogénhíd-kötések ugyanis nyeleket és hurkokat hoznak létre, és csökkentik a transzláció hatékonyságát. A témában jártas szakember érti, hogy szintetikus módszerekkel (lásd előbb) a 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
