202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására

1

HU 202281 B

2

a) 5’ CTAGAGGGTATTAATA ATG AAA GGG AAT TCT ATG I I I II I I I I II I I I I I I III MIMIIM TCCCATAATTAT TAC TTT CCC TTA AGA TAC

GCC TTC CCA GCC ATG TCC TTG TCC GGC CTG

III III III II I I I I III III III III III

CGG AAG GGT CGG TAC AGG AAC AGG CCG GAC

TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’

III III III II I I

AAA CGG TTG CGA C 5’

b) 5’ CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCC ATG GCT I I I II I I II II II I II I III III II I III 3’ TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGG TAC CGA

CTA TCT GGT CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’

II I III III II II II III III I II I

GAT AGA CCA GAC AAA CGG TTG CGA C 5’

c) 5’ CTAGAGGGTATTAATA ATG TTT CCA GCT ATG TCT I II I I II I II I II I I II III III III III 3’ TCCCATAATTAT TAC AAA GGT CGA TAC AGA

CTA TCT GGT CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’

III III III I II II I III III III I

GAT AGA CCA GAC AAA CGG TTG CGA C 5’

A kapott, sorrendben pCZ1920, pJRl és pAT2 plazmidoknak nevezett termék tartalmazza:

1. az E. coli lipoprotein gén transzkripciós és transzlációs aktivációs szekvenciáját [Nakamura és Inouye, Cell, 18, 1109 (1979)] egy biológiailag aktív szarvasmarha növekedési hormon- származékot meghatározó kódoló szekvenciával leolvasási fázisban;

2. egy megfelelően elhelyezett transzlációs stop jelet, és

3. egy úgynevezetett runaway replikont.

A pCZ1920, pJRl és pAT2 plazmidokkal transzformáit sejtek sorrendben az alábbi proteineket fejezik ki:

MET-LYS-GLY-ASPN-SER-MET-ALA-bGH-MET-PHE-PRO-ALA-MET-ALA-R2 és MET-bGH, ahol MET metionin,

LYS lizin,

GLY glicin,

ASPN aszparagin,

SER szerin,

30 ALA alanin,

PHE fenil-alanin,

PRO propil,

bGH olyan szarvasmarha növekedési hormont reprezentáló természetes aminosav szekvencia, amely az 35 N-terminálisa (az első) fenil-alaninnal kezdődik,

R2 a szarvasmarha növekedési hormon természetes aminosav szekvenciája, amely a 6. aminosavval (leucin) kezdődik az N- terminális végtől számítva.

A mellékelt 9. ábrán adjuk meg a pCZ1920 és a 40 pJRl plazmidok restrikciós térképét.

A találmány oltalmi körébe tartozó további plazmidokat állíthatunk elő úgy, hogy egymástól függetlenül ligáljuk az alábbi Taql-HgiAI dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciákat a pCZIOl plazmid 10 45 kb nagyságú EcoRI-BamHI és 0,6 kb nagyságú Bam- HI-HgiAI fragmenseihez vagy a pNM608 plazmid 0,29 kb nagyságú EcoRI-Clal fragmenséhez:

a) 5’ CGACC ATG GAT GAT AAG TTT CCG GCT ATG TCT

III I I I II I II I III III III Ml III III

3’ TGG TAC CTA CTA TTC AAA GGC CGA TAC AGA

CTG TCC GGC CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’ I I I I II III III III III III Ilii GAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C 5’

b) 5’ CGACA ATG TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT III I I I I II III III I I I I I I III III III 3’ TGT TAC AAG GGT CGA TAC AGA GAT AGA CCA

CTG TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’ III III III II I I I I I GAC AAA CGG TTG CGA C 5’

4