202281. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szelektálható és önállóan replikálódó rekobináns dezoxi-ribonukleinsav expressziós vektorok előállítására
1 HU 202281 B 2 5’ 3’ CGACA ATG III Ml tgt tac TTC I I I AAG CCA GCT ATG TCT I I I I I I III III GGT CGA TAC AGA tenyésztéskor maximális mértékben bekövetkezik, mivel a replikon az indukció körülményei között nem szabályozza a plazmid példány számát. CTA TCT GGT CTG TTT GCC AAC III III III III III III III GAT AGA CCA GAC AAA CGG TTG GCT GTGCT 3’ Ilii CGA C 5’. A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk 15 elő. A szintézis módszerét részletesen szemléltettük az 1. példában. A kapott, itt E. coli K12 RV308/pATl transzformánsokat kanamicint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezután a pAtl plazmid termelésére és izolá- 20 lására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézises vizsgálat, a RIA és más vizsgálatok szerint jelentős mértékben fejezi ki a fentiekben megadott Met-bGH származékot. Mivel a pATl plazmid termoindukálható „elveszthető”, úgy- 25 nevezett runaway repl ikont tartalmaz, amely az indukció körülményei között nem képes szabályozni a példányszámot, a bGh származék kifejeződése maximális mértékben bekövetkezik 37 °C tenyésztési hőmérsékleten. 9. példa A pASPl plazmid és az E. coli K12 RV308/pASPl törzs előállítása A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal 35 a különbséggel, hogy a 7. példában ismertetett linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát használjuk: 5’ CGACC ATG GAT TTT CCG GCT ATG III III IN I I I I I 1 III III 3’ TGG TAC CTA AAA GGC CGA TAC TCT CTG TCC GGC CTG ITT GCC III III III III III III III AGC GAC AGG CCG GAC AAA CGG TTG CGA C 5’. A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Orca és munkatársai (1978) ismert módszerei szerint állítjuk elő. A szintézist az 1. példában részletesen ismertettük. 55 Az itt E. coli K12 RV308/pASPl jellel jelölt transzformánsokat megfelelő antibiotikumokat tartalmazó TY agaron szélesztjük, és a pASPl plazmid termelésére és izolálására ismert módon tenyésztjük. A transzformánsok az SDS gél-elektroforézis, a RIA vizsgálat és 60 más kísérletek szerint nagymértékben kifejezik a fentiekben ismertetett Met-Asp-bGH származékot. Mivel a pASPl plazmid termoindukálható, úgynevezett „runaway” replikont tartalmaz, a bGH származék kifejeződése 37 °C hőmérsékleten végzett 65 5 10. példa A pASP2 plazmid és az E. coli K12 RV308lpASP2 törzs előállítása A 7. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 7. példában használt linker 10 szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav szekvenciát használjuk: 5’ CGATC ATG GAT TTT CCG GCT ATG I II I II III I I I I I I III III TAG TAC CTA AAA GGC CGA TAC TCT CTG TCC GGC CTG TTT GCC III III III III III III II I AGA GAC AGG CCG GAC AAA CGG AAC GCT GTGCT 3’ I I I I II I TTG CGA C 5’. A linker szekvencia előállítására Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint járunk el. A szintézis módszerét az 1. példában részletesen ismertettük. Az itt E. coli K12 RV308/pASP2 jellel jelzett 30 transzformánsokat kanamicint tartalmazó TY agaron szélesztjük, és ezutí" ° oASP2 plazmid termelésére és izolálására ia.*,crt módón tenyésztjük. A transzfrománsok az SDS gél-eletroforézis, RIA és más vizsgálatok szerint nagymértékben fejezik ki az előzőekben ismertetett Met-Asp-bGH származékot. Mivel a pASP2 plazmid termoindukálható, úgynevezett runaway replikont tartalmaz, 37 °C tenyésztési hőmérsékleten a kívánt bGH származék maximális mértékben fejeződik ki, mivel a replikon nem sza- 40 bályozza a példányszámot. 11. példa A pAT2 plazmid és az E. coli K12 RV308lpAT2 törzs előállítása 45 A 3. példában megadottakat ismételjük meg, azzal a különbséggel, hogy a 3. példa C. pontjában megadott linker szekvencia helyett az alábbi dezoxi-ribonukleinsav linker szekvenciát használjuk: 50 5’ CTAGAGGGTA TTAATA ATG TTT CCA II I II I II III I I I I I I I III 3’ TCCCA TAATTA T TAC AAA GGT GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTG III III I I I I I I III I I I I I I CGA TAC AGA GAT AGA CCA GAC TTT GCC AAC GCT GTGCT 3’ III III III III I AAA CGG TTG CGA C 5’. A fenti linker szekvenciát Itakura és munkatársai (1977) és Crea és munkatársai (1978) szerint állítjuk el ismert módon. A fenti szintézis módszert az 1. példában részletesen ismertettük. 24
