202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
13 HU 202280 B 14 Az oligo dT-vel kiegészített telep-készlet átvizsgálása urokináz szekvenciákra vonatkozólag Mikrotitráló edények bemélyedéseibe bemért LB táptalajhoz és 5 Mg/ml mennyiségű Letraciklinhez (48) hozzáadtunk beoltás céljából mintegy 10 000 telepet egyenként, majd dimetil-szulfoxidot adtunk hozzá 7% koncentráció eléréséig, és -20 °C-on tároltuk. A készlet egyes tenyészeteit Scleicher és Schuell BA85/20 nitrocellulóz szűrőkre vittük át, és agar-agar lemezeken tenyésztettük, amelyek LB táptalajt és 5 Mg/ml tetraciklint tartalmaztak. A tenyésztést mintegy 10 órán át folytattuk 37 °C-on, majd a telepeket tartalmazó szűrőket olyan agar-agar lemezekre vittük át, amelyek LB táptalajt, 5 Mg/ml tetraciklint és 12,5 Mg/ml klorarofenikolt tartalmaztak, s egy éjszakán át inkubáltuk 37 °C-on. Az egyes telepekből származó DNS-t denaturáltuk, és a szűrőhöz rögzítettük a Grunstein-Hogness-féle eljárás (49) módosításának alkalmazásával. Minden egyes szűrőt 3 percig tartottunk 0,5 N nátrium-hidroxidot és 1,5 M nátrium-kloridot tartalmazó oldat tetején, hogy elbontsuk a tenyészeteket és denaturáljuk a DNS-t. A szűrőket ezután semlegesítettük oly módon, hogy 3 N nátrium-kloridot és 0,5 M trisz-hidrokloridot (pH = = 7,5) tartalmazó oldat tetején lebegtettük őket 15 percig. A szűrőket további 15 percig tartottuk 2XSSC oldat (nátrium-kloridot és nátrium-citrátot tartalmazó vizes oldat, amely a hibridizációhoz szükséges só-komponenseket szolgáltatja) felszínén, majd 2 órán át szárítottuk őket 80 °C-on, vákuum-szárítószekrényben. A szűrőket előhibridizáltuk mintegy 2 órán át szobahőmérsékleten a következő öszszetételű oldatban: 0,9 M nátrium-klorid, 1 1 Denhardts-oldatban (kereskedelmi forgalomban beszerezhető, polivinil-pirrolidont és marha szérum-albumint tartalmazó oldat), 100 mM trisz-hidroklorid (pH = 7,5), 5 mM etilén-diamin-tetraecetsav-nátrium6Ó, 1 mM ATP, 1 M nátrium-foszfát (kétbázisú), 1 mM nátrium-pirofoszfát, 0,5% NP-40 és 200 Mg/ml Escherichia coli t-RNS, majd egy éjszakán át hibridizáltuk ugyanebben az oldatban lényegében a Wallace és munkatársai által leirt módon (50), mintegy 40 x 10® cpm mennyiséget használva a két-két CB6 dezoxioligonukleotidból álló, kinázzal kezelt elegyekből. A szűrőket alaposan mostuk 37 °C-on 6X SSC és 0,1% SDS tartalmú oldatban, majd Kodak XR-5 röntgenfilmet exponáltunk velük DuPont Lightning-Plus erősítő szűrők alkalmazásával 16-24 órán át -80 °C-on. Két tenyészetnél mutatkozott hibridizáció a nyolc minta keverékével: UK513dT69D2 (pD2) és UK513dT73D12 (PD12). .A pD2 és pD12 plazmid DNS jellemzése Az Escherichia coli UK513dT69D2 és UK513dT73D12 tenyészetből gyors mikroszürési módszerrel (51) elkülönített plazmid DNS-t PstI restrikciós endonukleázzal végzett analízisnek vetettük alá. Ez az analízis arra mutatott, hogy a pD2 és a pD12 azonos. Minden egyes plazmid DNS-nek három PstI restrikciós töredéke volt, amelyek a 6%-os poliakrilamid gélen keresztül végzett elektroforézisnél együtt vándoroltak. A plazmid pD2 cDNS betétjének teljes nukleotid szekvenciáját a didezoxinukleotidos lánclezáró módszerrel (52) határoztuk meg, miután a PstI restrikciós töredékeket az mp7 M13 vektorba (53) alklónoztuk. Az 1. ábrán a pD2 cDNS betéttöredékének nukleotidszekvenciáját, a 2. ábrán pedig a lefordított aminosav-szekvenciát mutatjuk be. A kis molekulatömegű (33 kdalton) urokináz teljes kódoló tartományát elkülönítettük ezen az egyetlen nagy pD2 töredéken. Az ábrán feltűntetett kép szerint a CB6B (5’ GGATCGTTA/GTACAT) dezoxioligonukleotid nukleotidszekvenciája a 466-479 számú nukleotidokat tartalmazza. Jellegzetes szerin proteáz aktív hely (gly, asp ser gly gly pro) található a 222. és a 227. aminosav között. A kódoló tartomány a nagy molekulatömegű (54 kdalton) urokináz karboxilcsoportban végződő része 279 aminosavának 838 bázispárjából áll. A 3’ lefordítat n szekvencia mintegy 935 nukleotidja a 280-as helyzetű aminosavnál levő UGA megállító kodontól a poliA szekvenciáig tart. Tekintettel arra, hogy a teljes hosszúságú urokináznak mindössze 31 413 dalton molekulatömegű részét kódolta a pD2 cDNS betétje, további tenyészeteket kellett létrehoznunk, amelyek urokináz szekvenciákat tartalmaztak, hogy azonosítani tudjuk a nagy molekulatömegű urokinázt. Két különböző, specifikus telepkészlet kialakítása a meglévő urokináz klón aminovégcsoportú meghosszabbításához. Az első specifikus cDNS készlethez primerként az oligo dTi2-is helyett egy 45 bázispárból álló urokináz DNS restrikciós endonukleáz töredéket használtunk, amelynek Haell kezdete volt a 225-ös helyzetben, a vége pedig AccI volt 270-es helyzetben (1. ábra). Ezt a töredéket hőkezeléssel denaturáltuk 20 Mg frakcionálatlan Detroit 562 poli A mRNS jelenlétében, és a korábban ismertetett módon állítottuk elő a cDNS-t. 11,5 ng mennyiségű, 200 bázispárnál nagyobb cDNS kettős spirált nyertünk ki elektroelúcióval 6%-os poliakrilamid gélből, és felhasználtuk mintegy 6000 klón előállításához Escherichia coli 294 törzsben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 9
