202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
7 HU 202280 B 8 Például a béta-laktaméz és laktóz promotor rendszereket előnyösen alkalmaztuk heterológ polipeptidek mikrobák által történő termelésének beindítására és fenntartására. Ezeknek a promoter rendszereknek az előállításával kapcsolatos részleteket a (18) és (19) hivatkozás tárgyalja. Újabban egy, a triptofán közvetítésével működő rendszert, az úgynevezett trp promoter rendszert fejlesztették ki. Az ennek a rendszernek az előállításával kapcsolatos részleteket a (20) és (21) hivatkozás tartalmazza. Számos más mikrobiológiai promotort is felfedeztek és felhasználtak, s a nukleotid szekvenciákkal kapcsolatos részleteket - amelyek lehetővé teszik a szakember száméra, hogy funkcionálisan behelyezze őket a plazmid vektorokba - publikálták. Lásd a (22) szakirodalmi helyet. Sejttenyészet rendszerek/sejttenyészet vektorok A gerincesektől származó sejtek tenyészetében történő szaporítása (szövettenyészet) rutin eljárássá vált az utóbbi években (lásd 31). Heterológ fehérje termeléséhez hasznos gazdasejt a majomvese fibroblasztok COS-7 vonala (32). A találmány értelmében azonban minden olyan sejtvonal alkalmazható, amely képes reprodukcióra és valamely öszszeférhető vektor termelésére. Ilyen sejtvonalak például a következők: WI38, BHK, 3T3, CHO, VERŐ és HeLa sejtvonalak. Továbbá, a termelő vektornak a következőket kell tartalmaznia: a kifejezni kívánt gén előtt elhelyezkedő reprodukció-eredet és promoter, az esetleg szükséges riboszóma kötési helyek, RNS illeszkedési helyek, poliadenilezési hely és az átiráslezáró szekvenciák. Magétól értetődik, hogy a találmány - jóllehet egy előnyös kiviteli alak kapcsán Írjuk le - nem korlátozódik ezekre a szekvenciákra. Például más virus (például Polyoma, Adeno, VSV, BPV stb.) vektorok reprodukciójának eredete is alkalmazható, valamint a DNS-reprodukció setjteredete is használható, amely különálló állapotban működhet. A gerincesektől származó gazdasejtek- , ben a találmány szerinti urokináz polipeptidre vonatkozó genetikai kifejező vektor egy másodlagos genetikai kódoló szekvenciát is tartalmazhat, amely ugyanennek a promotornak az irányítása alatt áll. A másodlagos szekvencia megfelelő szűrést biztosit általában a transzformánsok, valamint olyan transzformánsok számára, amelyek nagy mennyiségben termelik az elsődleges szekvenciát, továbbá szabályozó szerkezetként szolgálhat, amellyel a kívánt urokináz polipeptid termelése szabályozható, a leggyakrabban növelhető. Ennek különösen nagy fontossága van, mivel a két fehérje külön-külön képződik, érett alakban. Jóllehet mindkét DNS-kódoló szekvenciát ugyanaz az átírás promoter szabályozza, úgy, hogy összekapcsolt üzenet (mRNS) képződik, ezeket lefordításmegállító jel választja el az elsőnél, s startjel a másodiknál, így két független fehérje jön létre. Felismertük, hogy a környezeti feltételek gyakran hatékonyan szabályozzék a sejtek által meghatározott feltételek mellett termelt enzimek mennyiségét. A találmány egy előnyös változatánál felhasználjuk azt, hogy bizonyos sejtek érzékenyek a metotrexétra (MTX), amely a dihidrofolát-reduktáz (DHFR) inhibitora. A DHFR olyan enzim, amelyre közvetetten szükség van azokhoz a szintézisekhez, ahol egy szénegység átvitele történik. A DHFR aktivitás hiánya azt eredményezi, hogy a sejtek nem képesek növekedésre, csak olyan vegyületek jelenlétében, amelyek egyébként egy szénegység átvitelét igénylik a szintézisükhöz. A DHFR-hiányos sejtek azonban növekednek glicin, timidin és hipoxantin együttes jelenlétében. Ismeretes, hogy a metotrexát gátolja azokat a sejteket, amelyek általában DHFR-t termelnek. A legtöbb esetben, ha megfelelő mennyiségű metotrexátot adunk a normális sejtekhez, azok elpusztulnak. Úgy tűnik azonban, hogy bizonyos sejtek túlélik a metotrexátos kezelést megnövelt mennyiségű DHFR termelésével, és ezáltal túlszárnyalják a metotrexátnak azt a képességét, amellyel ezt az enzimet gátolja. Korábban kimutatták, hogy ezekben a sejtekben megnövelt mennyiségű üzenethordozó RNS található, amely a DHFR-szekvenciát kódolja. Ezt azzal magyarázhatjuk, hogy az ezt az üzenethordozó RNS-t kódoló genetikai anyagban megnövelt mennyiségű DNS-t tételezünk fel. Valóban, metotrexát hozzáadása a DHFR gén erósitését okozza. A DHFR szekvenciával fizikailag öszszekapcsolt, ugyanazon promoter által azonban szabályozott genetikai szekvenciák szintén megnövekednek. Következésképpen, lehetőség van arra, hogy a DHFR génnek a metotrexáttal végzett kezeléssel kiváltott felerősítését felhasználjuk egy másik fehérjére, a jelen esetben a kívánt urokináz polipeptidre vonatkozó gén együttes felerősítésére. Emellett, ha a gazdasejtek, amelyekbe a DHFR-re vonatkozó másodlagos szekvenciát bevisszük, DHFR-hiányosak, akkor a DHFR alkalmas jelzőként is szolgál az eredményesen átfertőzött sejtek kiválasztásához. Ha a DHFR szekvencia ténylegesen összekapcsolódott a kívánt polipeptidre vonatkozó szekvenciával, ez a képes egyúttal jelzőként is szolgál a kívánt szekvenciával történő sikeres átfertőzéshez. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
