202280. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkcionális humán urokináz fehérjék előállítására
28 HU 202280 B (9 225 000 Ne/mg), feltételezve, hogy 1 mg/ /ml OÜ280 értéke 1,3. 27 Az urokináz termelésének kimutatása Kromogén alapanyag A vizsgálat elméleti alapjai A vizsgálat alapja az, hogy egy tripeptidet proteolitikus úton kihasítunk egy kromofor csoportból. A hasítás mértéke egyenesen arányos a vizsgált proteáz specifikusságával és koncentrációjával. Az urokináz hasítja az S2444 kromogén alapanyagot (forgalmazó: Kabi Group Inc., Greenwich, CT). A kromofor csoport képződésének ellenőrzésével meghatározhatjuk a mintában jelenlevő funkcionális urokináz mennyiségét. A szintézis során az urokináz az inaktív elővegyület alakjában képződik, s aktiválás akkor történik, ha hasadás következik be a 26-os maradék (lizin) és a 27-es maradék (izoleucin) között. (A számozás a 2A. ábrán látható proteáz kiónon alapul). Azt tapasztaltuk, hogy egyes urokináz készítményeknél önaktiválódás lép fel és/ /vagy az Escherichia coli proteázok aktiválják őket. Az urokináz aktiválásának biztositásához - lehetővé téve a fenti kromogén módszerrel való kimutatást - a mintát kis mennyiségű tripszinnel kell kezelnünk. A tripszin olyan proteáz, amely képes a lizin és izoleucin közötti kötés elhasítására, amire szükség van az urokináz aktiválásához. A tripszin azonban a kromogén alapanyagot is hasíthatja, ezért a vizsgálat elvégzéséhez el kell távolítanunk. A szójabab tripszin inhibitor (STI) olyan fehérje, amely inaktiválja a tripszint, ugyanakkor azonban nincs hatással az urokinázra. Ezért a vizsgálat során az urokinázt tripszinnel aktiváljuk, majd a tripszint szójabab tripszin inhibitorral gátoljuk, végül pedig hozzáadjuk a mintához a kromogén alapanyagot, hogy meghatározzuk a jelenlevő funkcionális urokinázt. A vizsgálat kivitelezése A vizsgálat kivitelezése a kővetkezőképpen történik. 0,2 ml 0,1 M trisz-oldatot (pH = 8), 50 pl vizsgálandó mintát és 5 pl tripszint (0,1 mg/ml 0,1 M trisz, pH = 8 és 0,25 M kalcium-klorid) mértünk be egy kémcsőbe, és a mintát 10 percig inkubóltuk 37 °C-on. A tripszint 2 pl 10 mg/ml koncentrációjú STI-oldattal, amely 0,1 M triszt tartalmazott (pH = 8,0), inaktiváltuk. Az urokináz aktivitásét úgy határoztuk meg, hogy 50 pl 1 mM vizes S2444-oldatot adtunk hozzá, és a reakcióelegyet 10 percig inkubáltuk 37 °C-on. A reakciót 50 pl ecetsav hozzáadásával állítottuk le, és az oldatot centrifugáltuk a képződött csapadék eltávolítása érdekében, majd mértük az oldat abszorbanciáját 405 nra-nél. Az urokináz tényleges mennyiségét úgy számíthatjuk ki, hogy összehasonlítjuk a 5 mintát ismert mennyiségű urokinázt tartalmazó standard oldat megfelelő hígításaival. (Ehhez az urokinázt a Calbiochem cégtől szereztük be, San Diego, California). 10 A plazminképződés közvetlen vizsgálata A vizsgálat elméleti alapjai Lényegesen érzékenyebb módszerrel 15 mérhetjük az urokinázt, ha a plazminogénnek plazminná történő, az urokináz által katalizált átalakulását ellenőrizzük. A plazmin enzim, amelynek meghatározására rendelkezésre állnak kromogén alapanyag felhasználásával 20 történő vizsgálatok. Ezek elve ugyanolyan, mint az előzőekben fentebb leírt vizsgálaté. A vizsgálat azon alapul, hogy meghatározzuk a képződött plazmin mennyiségét, miután az urokinázt tartalmazó oldatot plazminogén ol- 25 datával inkubáltuk. Minél nagyobb mennyiségű urokináz van jelen, annál nagyobb menynyiségű plazmin képződik. 30 A vizsgálat kivitelezése A minta alikvot részét összekevertük 0,10 ml 0,7 mg/ml koncentrációjú plazminogénnel (a plazminogén oldata 0,5 M trisz-hid- 35 rokloridot, pH= 7,4) és 0,012 M nátrium-kloridot tartalmazott), és az elegy térfogatát 0,15 ml-re állítottuk be. Az elegyet különböző ideig - amint azt megadtuk - inkubáltuk 37 °C-on, majd 0,35 ml S2251 oldatot (1,0 mM 40 oldat a fenti pufferben) adtunk hozzá, és tovább reagáltattuk 5 percig 37 °C-on. A reakció befejezése érdekében 25 pl ecetsavat adtunk hozzá, és mértük az abszorbanciát 405 nm-en. Az aktivitás számszerű mértékét 45 standard urokináz-oldat hígításaival végzett összehasonlítással kaptuk meg. A plazminképződés közvetett vizsgálata 50 A vizsgálat elméleti alapjai Érzékeny módszert fejlesztettek ki az urokináz aktivitásának meghatározására (61). 55 A módszer a plazminképződés meghatározásán alapul, amelynek során fibrint és plazminogént tartalmazó agar-agar lemezen mérjük a fibrin plazmin hatására bekövetkező feltárásának mértékét. A plazmin éles elbontási zó- 60 nát hoz létre a fibrint tartalmazó lemezen. Az elbontási zóna nagysága és a mintában lévő urokináz mennyisége között összefüggés állítható fel. 65 16
