202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
13 HU 202279 U 14 Penicillin-termelő organizmusok sejtmentes extraktumait lehet használni nem természetes (vagyis a természetben nem termelődő) á-laktárnok szintetizálására. A jelen találmány szerinti E. coli kifejeződő vektorok olcsó és hatékony módszert nyújtanak izopenicillin N-szintetáz nyerésére, amelyet azután in vitro lehet alkalmazni olyan tripeptidek kondenzálására, amelyek a természetben nem fordulnak elő, hogy új antibiotikumokat vagy antibiotikum alapszerkezeteket képezhessenek. A nem természetes tripeptidek kutatását, amelyek szubsztrátumként szolgálhatnak az izopenicillin N-szintetázhoz, ki lehet egészíteni mutáns izopenicillin N-szintetázok kutatásával, amelyek elfogadják a nem természetes tripeptídeket, mint szubsztrátumokat. A jelen találmány adja a kiindulási anyagokat egy ilyen kutatáshoz mutáns izopenicillin N-szintetózok számára. Az E. coli a legjobb gazdaszervezet mutációs klónozási kísérletekhez, és a jelen találmány szerinti E. coli kifejeződő vektorokat könnyen lehet mutációnak alávetni a szakterületen jól ismert eljárásokkal, így pl. besugárzásos kezeléssel (röntgen- vagy UV-sugárzás), vagy kémiai mutagénekkel (mint etil-metánszulfonát, nitrozoguanidin, vagy metil-metánszulfonát), vagy hely-specifikus mutagenezissel, hogy mutáns enzimeket nyerjünk, amelyek szubsztrátumként ismernek fel nem természetes tripeptídeket, és katalizálják ezeknek a nem természetes tripeptideknek a kondenzálását nem természetes /5-laktámokká. A jelen találmány nem korlátozódik kizárólag azokra a vektorokra, amelyeket itt példaként felhozunk. A jelen találmány valójában magában foglalja mindazokat a DNS vegyületeket, amelyek izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódolnak. A jelen találmány szerinti DNS vegyületeket lehet alkalmazni olyan kifejeződő vektorok megalkotására, amelyek elősegítik az izopenicillin N-szintetáz kifejeződését, bármilyen gazdasejtben, amelyben a kifejeződő vektor replikálódik vagy integrálódik, és amelyben izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejezésére használt átiró- és transzlációs aktiváló szekvencia működik. Ezért, bár az itt példaként felhozott E. coli kifejeződő vektorok egy E. coli-ban funkcionális .elszabadult* replikont hasznosítanak, a jelen találmány magában foglal mindenféle E. coli kifejeződő plazmidot vagy vektort, amely elóreviszi az izopenicillin szintetáz kifejeződését E. coli-ban. így a jelen találmány magában foglalja azokat a kifejeződő vektorokat, amelyek elősegítik az izopenicillin N-szintetáz kifejeződését és egy E. coli-ban funkcionális replikont hasznosítanak, ilyenek pl. a pBR322, pACYC184, F, ColV-K94, RI, R6-5 vagy R100 plazmidokból származó replikonok. A jelen találmány nem korlátozódik csupán plazmid vektorokra sem, a jelen találmány magában foglal olyan kifejeződő vektorokat is, amelyek izopenicillin N-szintetáz aktivitást fejeznek ki és integrálódást vagy virális replikációt hasznosítanak, hogy a replikációt és a fenntartást szolgáltassák a gazdasejtben. A jelen találmány nem korlátozódik egy bizonyos átiró és transzlációs aktiváló szekvenciára, amely elősegíti az izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS kifejeződését. A jelen találmány magában foglalja bármilyen átíró és transzlációs aktiváló szekvencia alkalmazását, amely E. coli-ban funkcionál, és arra használható, hogy izopenicillin N-szintetázt fejezzen ki E. coliban. Több, E. coliban működő átiró és transzlációs aktiváló szekvencia ismeretes és alkalmas izopenicillin N-szintetáz aktivitás kifejeződésének elősegítésére E. coli-ban. Az ilyen átiró és transzlációs aktiváló szekvenciák lehetnek (bár nem korlátozódnak csak ezekre) az lpp, lac, trp, Lac, aPl és aPR átiró és transzlációs aktiváló szekvenciák. Az itt példaként felhozott különböző E. coli átíró és transzlációé aktiváló szekvenciákon túl más organizmusokból származó átiró és transzlációs aktiváló szekvenciákat is lehet ligálni a jelen izopenicillin N-szintetézt kódoló DNS anyagokhoz, hogy olyan kifejeződő vektorokat képezzünk, amelyek elősegítik az izopenicillin N-szintetáz aktivitást a gazdasejtekben, amelyekben az aktiváló szekvencia működik. Bér az E. coli a gazdaszervezet, amely a legjobban illik az izopenicillin N-szintetáz termeléshez és az ezt követő tisztításhoz in vitro használatra, olyan vektorok is használhatók, amelyek az izopenicillin N-szintetáz aktivitást E. colitól eltérő gazdaszervezetben segítik elő, különösen az adott organizmus ű-laktám antibiotikum-termelő képességének és hatékonyságának növelése céljából. Nagyon sokféle organizmus termel ß-laktám antibiotikumokat. Az itt következő táblázat a B-laktám antibiotikum-termelő organizmusok nem mindenre kiterjedő listáját nyújtja. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 9
