202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
9 HU 202279 B 10 870 880 890 900 910 AAC CTG GGC TGG GAG GAC ACC ATC CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC ASN LEU GLY TRP GLU ASP THR ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA 290 295 300 920 930 940 950 960 AAG GAT GGG GCC AAG GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC ATC TCC TAC LYS ASP GLY ALA LYS ASP ALA ALA LYS ASP LYS PRO ALA ILE SER TYR 305 310 315 320 970 980 990 1000 GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG AAT GGT GLY GLU TYR LEU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY 325 330 335 1010 CAG ACC TAA-3’ GLN THR ahol A jelentése dezoxi-adenil, G jelentése dezoxi-guanil- C jelentése dezoxi-citidil és T jelentése timidil-csoport, míg A1A jelentése alanin-győk, ARG jelentése arginin-gyók, ASN jelentése aszparagin-győk, ASP jelentése aszparaginsav-győk, CYS jelentése cisztein-gyök, GLN jelentése glutamin-gyök, GLU jelentése glutaminsav-gyök, GLY jelentése glicin-gyök, H1S jelentése hisztidin-gyök, ILE jelentése izoleucin-gyök, LEU jelentése leu- 3<^ cin-gyök, LYS jelentése lizin-gyök, MET jelentése metionin-gyök, PHE jelentése metionin-gyök, PHE jelentése fenil-alanin-gyök, PRO jelentése prolin-győk, SER jelentése szerin-gyök, THR jelentése treonin-gyök, ^ TRP jelentése triptofán-gyök, TYR jelentése tirozin-gyök és VAL jelentése valin-gyök. A fentebb bemutatott DNS szekvencia ^3X-ban G-t és C-t tartalmaz, és az izopenicillin N-szintetáz polipeptidet kódolja, 38,476 dalton számított molekulatömeggel és mintegy 40000 dalton észlelt molekulatömeggel. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a fentebb ábrázolt DNS szekvencia a jelen találmány fontos része. A fenti ^5 szekvenciát hagyományos módon lehet szintetizálni a módosított foszfotriészter módszerrel, teljesen védett dezoxiribonukleotid építőelemeket alkalmazva. Az ilyen szintetikus módszerek jól ismertek a szakterületen és ^0 lényegében a következő irodalmi helyeken leirt módszerekkel összhangban lehet elvégezni: Itakura és munkatársai: Science, 198, 1056 (1977); és Crea és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75, 5765 (1978). Ezeken 55 kívül egy különösen előnyös módszer található a következő irodalmi helyeken: Hsiung és munkatársai: Nucleic Acid Research 11, 3227 (1983); és Narang és munkatársai: Methods in Enzymology 68, 90 (1980). A fentebb referált kézi módszereken kivül a DNS szekvenciát lehet szintetizálni automatizált DNS szintetizátorokat, pl. Systec 1450A- vagy ABS 380A DNS szintetizátorokat alkalmazva. A genetikai kód degenerált természetének következtében, amely azt eredményezi, hogy több, mint egy kodon kódolja a legtöbb aminosav-gyököt és stop-szignált, az izopenicillin N-szintetáz fentebb ábrázolt aminosav-gyök szekvenciáját különböző DNS szekvenciák sokasága kódolhatja. Mivel ezek a váltakozó DNS szekvenciák ugyanazt a jelen találmány szerinti aminosav-gyök szekvenciát kódolhatják, a jelen találmány magában foglalja ezeket a váltakozó szekvenciákat is. Ezenkívül a jelen találmány szerinti izopenicillin N-szintetázt kódoló DNS-nek lehetnek genetikai variánsai is. Ezek a genetikai variánsok lényegében DNS és aminosav gyök szekvencia-homológiát mutatnak a jelen találmány szerinti vegyületekkel, és mutathatnak hasonló, vagy akár azonos aktivitást, de valamelyest mégis eltérnek a tényleges, jelen találmány szerinti vegyületektől. Ezek a genetikai variánsok ekvivalensek a jelen találmány szerinti vegyületekkel. A jelen találmány szerinti, izopenicillin N-szintetáz aktivitást kódoló DNS vegyületeket egy Cephalosporium acremonium törzsből izoláljuk, amelyet általában Brotzu törzsként ismernek, és amely rendelkezésre áll az American Type Culture Collectionnál (ATCC, Rockville, Maryland), ATCC 11550 letéti számon. A C. acremonium törzs teljes genom DNS-ének genom könyvtárát megalkotjuk, és a genom könyvtárat szekvencia-homológia jelenlétére átvizsgáljuk 64 különböző dezoxiribooligonukleotidból álló készlethez. A 64 különböző dezoxiribonukleinsav készletét azzal az információval összhangban alakítjuk ki, amelyet a C. acremonium izopenicillin N-szintetáz amino-terminális aminosav-szekvenciájából és a genetikai kód ismeretéből nyertünk. A genom könyvtár vektorjainak széles választékát úgy azonosítjuk, hogy homológ-e a 64 különböző dezoxiribooligonukleotid egyikéhez vagy közülük többhöz. A DNS szekvencia-elemzés feltárja, melyik vektorok kódolják a C. acremonium izopenicillin N-szintetázt. 7
