202279. lajstromszámú szabadalom • Eljárás izopenicillin N-szintetáz és az azt kódoló DNS vegyületek előállítására
29 HU 202279 B 30 Minden szükséges térfogat-beáll! tést TES-t /[2-(trisz-hidroximetil-metil)-amino]-etánszulfonsav puffer/ alkalmazva végzünk, amely 0,761 g/ml CsCl-t is tartalmaz. A plazmid-csikot ismét izoláljuk, sóval telitett izopropanollal extraháljuk, hogy eltávolitsuk az etidium-bromidot, és 1 : 3 arányban higitjuk TES pufferban. Két térfogat etanolt adunk ezután az oldathoz, ezt követi az inkubálás egy éjszakán át -20 °C hőmérsékleten. A plazmid DNS-t centrifugálással kiülepitjük, a műveletet S534 rotorban (Sorvall) végezve 15 percen át, 10000 fordulat/percnél. Az ezzel az eljárással nyert mintegy 1 mg pIT335 plazmid DNS-t 1 ml TE pufferban szuszpendáljuk (10 mmól/liter Trisz-HCl, pH 8,0, és 1 mmól/liter EDTA) és -20 °C hőmérsékleten tároljuk. A pIT335 plazmid restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül az 1. ábra mutatja be. 2. példa A plT337 plazmid megalkotása E. coli K 12 RV308/pCZ106 tenyésztése és a PCZ106 plazmid izolálása Az E. coli K 12 RV308/pCZ106 tenyészetét a Northern Regional Research Laboratories-től (Peoria, Illinois) kapjuk meg, ahol ez az NRRL B-15959 letéti szám alatt található meg. A liofilezett tenyészetet használjuk 1 liter L-tápközeg inokulálására, amely még 50 Mg/ml kanamicint is tartalmaz, és az inokulált tápközeget 25 °C hőmérsékleten levegó-rázógépen inkubáljuk, amíg az optikai sűrűség (OD$90) 0,5 és 1,0 abszorpciós egységek közé esik. Amikor a tenyészet eléri a 0,5-1,0 abszorpciós egységet az optikai sűrűségben, a hőmérsékletet 37 °C-ra emeljük, és az inkubálást folytatjuk 2-6 órán át. Az .elszabadult' replikon, amint korábban megállapítottuk, hőmérséklet-érzékeny, és elveszti kópia8zám-szabályozását 37 °C hőmérsékleten. A 2-6 órán inkubálás 37 °C hőmérsékleten elegendő időt szolgáltat a nem szabályozott replikációhoz. A 2-6 órás, 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után a sejteket összegyűjtjük, a PCZ106 plazmid DNS-t izoláljuk lényegében az 1B. példa eljárása szerint. Mintegy 5 mg pCZ106 plazmid DNS-t nyerünk, és ezt 5 ml TE pufferban felszuszpendáljuk. A pCZ106 restrikciós hely- és működési térképét a mellékelt ábrák közül a 2. ábrában adjuk meg. B.) A pCZIOő plazmid Ncol és BamHI emésztése és a pCZIOS plazmid ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol és ~ 1,6 kb-s NcoI-BamHI restrikciós fragmenseinek izolálása A 2A. példában előállított pCZ106 plazmid mintegy 25 pg“ját (amely 25 pl-nek felel meg) hozzáadjuk 10 pl 10 x BamHI reakciós pufferhoz [1,5 mól/liter NaCl; 60 mmól/liter Trisz-HCl, pH = 7,9; 60 mmól/liter MgCh; és 1 mg/ml bovin szérum albumin (BSA)), 5 jul (~ 50 egység) BamHI restrikciós enzimhez*, 5 ul ("50 egység) Ncol restrikciós enzimhez, és 55 ul vízhez, és az egészet összekeverjük. Az igy létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ez után a reakció lényegében teljessé válik. Az Ncol-BamHI reakciókeveréket ezután elektroforézisnek vetjük alá. 1%-os agaróz gélen, amíg a kívánt ~ 1,6 kb-s Ncól-Bamül és ~ 8,7 kb-s Ncol-Ncol fragmensek tisztán elkülönülnek a másik emésztési terméktől, a ~0,3 kb-s restrikciós fragmenstól. Az elektroforézisnek alávetett DNS láthatóvá tételét a gél festésével hajtjuk végre etidiura-bromid hig (0,5 ug/ml) oldatával, majd a festett gél hosszú hullámú UV fénynek való kitevésével. Miután a kívánt fragmenseket lokalizáltuk, egy kis metszést végzünk a gélben a kivént fragmensek mindegyike előtt, és egy kis darabka Schleicher and Schuell (Keene, NH 03431) Na-45 DEAE membránt helyezünk mindegyik bemetszésbe. A további elektroforézisre a DNS nem kovalensen kötődik a DEAE membránhoz. Miután a kívánt fragraenseket a DEAE membránhoz kötöttük, ezeket a membránokat eltávolitjuk és kis sókoncentrációjú puffer-oldattal öblítjük (100 mmól/liter KC1; 0,1 mmól/liter EDTA, és 20 mmól/liter Trisz-HCl, pH = 8). Ezután mindegyik membránt egy kis csőbe helyezzük, és nagy sókoncentrációjú pufferba merítjük be (1 mól/liter NaCl; 0,1 mmól/liter EDTA, és 20 mmól/liter Trisz-HCl, pH = 8), majd 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át, hogy eltávolitsuk a DNS-t a DEAE papírról. A 65 °C hőmérsékleten végzett inkubálás után az inkubáló puffert összegyűjtjük és a membránt nagy sókoncentrációjú oldattal öblitjük. Az öblítő oldatot egyesitjük az inkubáló pufferral, mielőtt a kívánt DNS fragmenseket öszszegyűjtjük. A nagy sókoncentrációjú DNS oldat térfogatát úgy állítjuk be, hogy az NaCl koncentráció 0,25 mól/liter legyen, majd 3 térfogat hideg, abszolút etanolt adunk hozzá. Az így létrejött oldatokat összekeverjük, és -70 °C hőmérsékletre helyezzük 10-20 percre. A lehűtés után az oldatot 15000 fordulat/percnél centrifugáljuk 15 percen át. Egy második kicsapás után a maradék só eltávolítása érdekében, a DNS üledéket etanollal öblítjük, szárítjuk, 20 ul TE pufferban újra szuszpendáljuk, és 5-5 ug-ot alakítunk ki a pCZ106 plazmid kívánt ~ 1,6 kb-s Ncől-BanMl 17 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
