202278. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott stabilitású, rekombináns gamma-interferonok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202278 D 2 A találmány tárgya dezoxiribonukleinsav-rekombinációs technológia alkalmazása fokozott aktivitású rekombináns gamma-interferonok előállítására, kiterjed továbbá az ennek során képződő különféle termékek előállítására. Az emberi eredetű interferonok három csoportba sorolhatók az eltérő antigén jelleg, valamint a biológiai és a biokémiai tulajdonságok alapján. Az első csoportba leukocita interferonok tartoznak, amelyeket általában az emberi vérben jelenlevő sejtek termelnek vírusos indukció hatására. Ezeket az interferonokat mikroorganizmusokkal állítják elő, és biológiailag aktivaknak bizonyultak (Goeddel, D. és munkatársai, Nature, 287, 411 (1980); Nature, 290, 20 (1981); Yelverton, E. és munkatársai, Nucleic Acids Research, 9, 731 (1981)]. Biológiai tulajdonságaik a gyógyításban történő felhasználásra ösztönöznek vírusos fertőzések és rosszindulatú daganatok kezelésénél (Gutterman és munkatársai, Annals of Int. Med., 93, 399 (1980)]. A második csoportba az emberi eredetű fibroblaszt interferon tartozik, amelyeket fibroblasztok termelnek vírusos indukció hatására. Előállításuk szintén mikroorganizmusok felhasználásával történik, és sokféle biológiai hatással rendelkeznek [Goeddel, D. és munkatársai, Nucleic Acids Research, 8, 4057 (1980)]. A klinikai kipróbálások szintén jelzik a lehetséges gyógyászati értékét. A leukocita és a fibroblaszt interferonok igen közeli hasonlóságot mutatnak a biológiai tulajdonságaik tekintetében, annak ellenére, hogy viszonylag csekély mértékben homológok aminosavszinten. Mindkét fenti interferoncsoport körülbelül 165-166 aminosavat tartalmaz, és savval szemben ellenálló fehérjék. Az emberi eredetű gamma-interferon (amelynek további elnevezése immun interferon, IIF vagy IFN-gamma) rendelkezik az interferonokra jellemző vírusellenes és sejtburjánzás-ellenes tulajdonságokkal, ellentétben azonban a leukocita és fibroblaszt interferonnal, érzékeny pH=2 értékű savas közeg behatására. A DNS-rekorabinációs módszerrel történő termelés előtt a gamma-interferonokat elsősorban a limfociták mitogén indukciójával állították elő. Az emberi eredetű gamma-interferon az antigén jelleg szempontjából élesen megkülönböztethető a leukocita és a fibroblaszt interferontól. Gray, Goeddel és munkatársai számoltak be elsőként egy rekombináns gamma-interferon képződéséről [Gray, P. és munkatársai, Nature, 295, 503-508 (1982)], amely az emberi eredetű gamma-interferon jellemző tulajdonságait mutatta, azaz vírusellenes és sejtburjánzás-ellenes hatású volt, s érzékeny volt pH=2 érték behatására. A Gray és Goeddel által előállított, Escherichia coli segítségével termelt rekombináns gamma-interferon 146 aminosavból állt, s a molekula N-terminális része CYS-TYR-CYS- szekvenciával kezdődött. Derynck és más kutatók leírtak [Dérynék, R. és munkatársai, Nucleic Acids Research, 10, 3605 (1982)] egy további rekombináns gamma-interferont, amelynek ugyanolyan N-végcsoportja van és egyetlen aminosav szubsztitúciót tartalmaz, s a polipeptid valószínűleg a korábban megadottnak [Gray, P. és munkatársai, Nature, 295, 503-508 (1982)] egy alléi változata. Más kutatók még további rekombináns gamma-interferonok termeléséről számoltak be. Ezeknél az interferonoknál feltehetőleg helyettesítve van egy vagy több olyan aminosav, amely szerepel Goeddel és Gray eredeti publikációjában [Gray, P. és munkatársai, Nature, 295, 503-508 (1982)]. Például Alton és munkatársai [.Production, Characterization and Biological Effects of Recombinant DNA Derived Human IFN-alpha and IFN-gamma Analogs', The Biology of the Interferon System, DeMaeyer and Schellekens, Eds., Elsevier Science Publ. 19831 egy sor olyan gamma-interferonról számolnak be, amelynél a Gray és munkatársai által leírt gamma-interferon 81-es helyzetű egyetlen aminosavjának helyettesítése mindössze 70X-os aktivitású terméket eredményezett, s az 1-es, 2-es és 3-as helyzetű cys-tyr-cys szekvencia törlése tovább csökkentette az aktivitást, és így olyan gamma-interferont kaptak, amely a Gray és munkatársai által vizsgált gamma-interferon aktivitásának csak 49%-ával rendelkezett. Kísérleteink során problematikusoknak bizonyultak azok a rekombináns gamma-interferonok, amelyek N-terminális aminosav-szekvinciája ciszteint tartalmaz, az oligomerizáció szempontjából, amelynél egy vagy több ciszteincsoport szulfhidrilcsoportjai részt vehetnek a diszulfidkötés kialakulásában. Az, hogy nem tudtuk tökéletesen redukálni ezeket a feltételezett diszulfidkötéseket, arra mutat, hogy ez a probléma összetettebb lehet, s a ciszteinhez kapcsolódó tirozin hidroxilcsoportja is részt vehet a reakcióban. Ezek a rekombináns gamma-interferonok valamivel kevésbé voltak stabilak, és vagy ennek folytán, vagy más okokból kifolyólag kevéssé voltak előnyösek. A találmány tárgyát fokozott stabilitású és aktivitású rekombináns gamma-interferonok előállítása képezi. Ezek közül különösen előnyös egy olyan rekombináns gamma-interferon, amely az N-végcsoporttól kezdve az alábbi aminosav-szekvenciát tartalmazza (a következők során ezt teljes szekvenciának nevezzük): X-Y-ASP-PRO-TYR-VAL-LYS-GLU-ALA-GLU- 12 345 6 7 89-ASN-LEU-LYS-LYS-TYR-PHE-ASN-ALA-GLY- 10 11 12 13 14 15 16 17 18 -H1S-SER-ASP-VAL-ALA-ASP-ASN-GLY-THR- 19 20 21 22 23 24 25 26 27 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
