202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
7 HU 202277 B 8 Ha ezeket az oligonukleotidokat összekapcsoljuk, majd utólag Sau 3A-val hasítjuk, megkapjuk a kívánt fragmentumot, amely az interferon gén részt (Sau 3A vég) a pER 103- -al (Hindui vég) összekötheti: I 12mer 14mer 5’ AGCTTAAAGATGTGTjGATCTGCCTCA 3! ATTTCTAC ACACtTAGftC _ 8mer 9mei | Hin dl II Sau 3A Met Cys Az oligonukleotidokat a találmány szerint úgy szerkesztjük, hogy az ATG iniciációs kodont és a TGT cisztein kodont külön fragmentumok tartalmazzák. Ez lehetővé teszi a 12mer (és 8mer) általános használatát géneknek a pER 103-ba történő inszertálásánál. Ezért a cisztein kodont tartalmazó oligonukleotidnak legalább 9 nukleotid hosszúságúnak kell lennie. Például az alábbi nukleotidok használhatók e célra: 5'TGTGATCTG, 5’TGTGATCTGC, 5’TGTGATCTGCC, 5'TGTGATCTGCCT vagy 5’TGTGATCTGCCTC. Például a 14mer-rel kapott, ligáz segítségével összekapcsolt oligonukleotidot Sau 3A-val emésztjük, hogy az interferon génhez megfelelő Sau 3A vég keletkezzék. Ezután az interferon génnek és az oligonukleotid komplexnek az összekapcsolása, ennek bekötése egy plazmidba, majd ezzel egy bakteriális gazdasejt, például Escherichia coli HB 101 transzformálása a szakirodalomból ismert eljárásokkal történik. Eukarióta géntermékek előállításánál a kitermelés további növelése érdekében előnyös lehet, ha az illető termelő plazmid az expresszióhoz szükséges DNS szekvenciák többszörösét, például kétszeresét tartalmazza, például két teljes érett interferon oCA-t kódoló gént, a bakteriális regulátor-szekvenciákkal együtt. Tehát az érett interferon génjét, amely egy bakteriális promoterrel, egy prokarióta riboszomális kötőhellyel és egy ATG iniciációs kodonnal rendelkezik, a találmány szerint előállított termelő plazmidból, például a pER 33-ból, izoláljuk, ezután e DNS darab két vége közül az egyiket módosítjuk, majd egy restrikciós enzim, például az Eco Rí segítségével a találmány szerint előállított, linearizált teljesen azonos plazmidba beépítjük. Előnyös továbbá, ha egy, a találmány szerint ilyen módon előállított, triptofán operont hordozó plazmid, mint például a pER 33 6 plazmid, egy par-lokusz-t tartalmaz, azaz egy olyan DNS szekvenciát, amely például egy antibiotikum - ilyen az ampicillin - által gyakorolt szelekciós kényszer elmaradásakor, a baktériumnövekedés folyamán a plazmidoknak a leánysejtekbe történő egyenletes átadáséért felelős [P. M Meacock, S. N. Cohen, Cell, 20, 529-542 (1980)1. Ezért először a pPM 31 plaimidból, amely az előbb megadott közleményben szerepel, izoláljuk a par-lokusz-t és bevisszük egy találmány szerint előállított interferon termelő plazmidba. Jelen találmány segítségével egy olyan expressziós plazmidot sikerült megszerkeszteni, amely a Serratia marcescens triptofán operonjának promoter/operétor szakaszát tartalmazza, valamint egy szintetikus RBS-t. Ennek a szerkezetnek baktériumidegen proteinek géntechnológiai előállításánál megnyilvánuló hatékonyságát a leukocita interferon példáján mutatjuk be. A következő példák a találmányt közelebbről világítják meg. A. ÁLTALÁNOS MÓDSZEREK ISMERTETÉSE 1) Emésztések restrikciós enzimekkel A restrikciós endonukleázokat, például a Bethesda Research Laboratories termékeit, az alábbi feltételek mellett alkalmazzuk: Eco Rl-el, HindIII-al, Pst I-el és Ava II-vel az emésztéseket TA-pufferben [33 mM trisz-acetát (pH=7,9), 66 mM kálium-acetót, 10 mM magnézium-acetát, 100 ug/ml BSA] végezzük: Hae III-al TM pufferben [70 mM trisz-sósav (pH=7,5), 7 mM magnézium-klorid] emésztünk; Sau 3A-val 10 mM trisz-sósav (pH=7,4), 10 mM magnézium-klorid és 75 mM nátrium-klorid tartalmú oldatban végezzük az emésztést. 2) Plazmid preparálás, gélelektroforézis A plazmidokat Bimbóim és Doly [Nucleic Acids Res., 7, 1513-1523 (1979)] előírása szerint preparáljuk, L-Broth táptalajban egy éjszakán át tartó tenyésztési idő után, 1,5 ml vagy 100-300 ml tenyészetből. Az L-Broth táptalaj 25 ug/ml tetraciklint, vagy 100 ug/ml ampicillint tartalmaz. A plazmidok további tisztítása izopropanoloB kicsapással (lásd alább) és nagyobb sarzsok esetén Sepharose 4B (Pharmacia) kromatografálással történik. Nagyobb mennyiségű plazmidot (1-6 liter tenyészetből) Clewell és Helinski [Biochemistry, 9, 4428-4440 (1970)] .cleared-lysate' módszerével dolgozunk fel, s ezt követi egy etidium-bromid - cózium-klorid grádiens centrifugálás. A plazmidok, illetve restrikciós enzimes emésztéssel kapott termékeik elektroforézisét 40 mM trisz-acetatot (pH=7,8), 20 mM nátrium-acetátot és 2 mM EDTA-t tartalmazó oldattal készített 0,8-1,4%-os agaróz gélben, 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
