202277. lajstromszámú szabadalom • Eljárás DNS-szekvenciák és ezeket a szekvenciákat tartalmazó plazmidok előállítására és felhasználásuk interferon szintéziséhez
3 HU 202277 B 4 5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3* GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG k--------------p romote r-----------------------------------------GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGGTAAGGAGGTTTA CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCCATTCCTCCAAATTCGA ---------promoter/operátor--------------------------------->k------RBS-----------M HindlII képletű DNS-szekvenciát tartalmazza, és olyan plazmidok, amelyekben ezután a pER103 plazmid egyetlen HindlII hasítási helyéhez oly módon kapcsolódik egy linker szekvencia és egy polipeptidet, előnyösen egy cC-interferont kódoló strukturgén szekvenciája, hogy ez baktériumokban kifejezhető legyen, például a pER33, pER21/l és parpER33 plazmidok, amelyek közül a parpER33 plazmid még egy par-lókuszt is tartalmaz. Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az így előállított termelő plazmidok alkalmazása valamilyen kívánt polipeptid, főleg érett cC-interferon, Így az 1F7 klón (DSM 2362) által kódolt érett oC-interferon baktériumokban való előállítására, valamint az cC-interferon előállítása és tisztítása. A szakirodalomból 3 humán interferon-tipus ismeretes: leukocita interferon (IFN—oC), fibroblaszt interferon (IFN-ß) és immun interferon (IFN-í). A leginkább tanulmányozott a vírusokkal stimulált leukociták által termelt oC-interferon [Antimicrob. Agents Chemother., 20, 5-9 (1981)]. Az IFN-oC gének molekuláris klónozása során kiderült, hogy az IFN-oC-t egy multigén család kódolja, amely legalább 10 megkülönböztethető génből áll, igy a termék nem egységes protein, hanem IFN-oCl,2,3... [vagy LelFN A,B,C... ] altípusok [Nature 287, 401 (1980) és 290, 20 (1981)] léteznek. Az IFN-oC gének közel hasonlók, és egymással kereszthibridizálnak. Az IFN-ß gén egyedüli génnek tűnik, IFN-ß altípusok nem ismertek. Az IFN-oC és -ß között nincs ke-10 reszthibridizáció, szekvenciáik mintegy 45X-ban homológok [Nature 285, 547 (1980)]. A leghosszabb azonos génszekvencia 13 báziB hosszúságú. Az IFN-oC és -ß klónozására például Namalwa cDNS-ből származó szekvenciá- 15 kát használnak [Journal of Interferon Research, Vol. 2. (4), 575-585 (1982)]. A találmány által kitűzött célok elérése érdekében például a következőképpen járunk el. 20 Alkalmas bakteriális promoter szekvencia kiválasztása Előnyösen olyan promotert alkalmazunk, 25 amely az operátor szekvenciával kombinációban indukálható, illetve represszálható. Egy ilyen promoternek az az előnye, hogy a kivánt baktériumidegen-fehérjének a szintézisét csak a bakteriális növekedési ciklus egy 30 későbbi szakaszában indíthatjuk meg, például a triptofán operon esetében [Hallewell és Emtage: Gene, 9, 27-47 (1980)] azáltal, hogy a táptalajból a triptofánt elvonjuk és azáltal, ha a táptalajhoz - a triptofán operon indu- 35 kálására - indol-3-akrilsavat adunk és így a baktériumok szaporodását nem befolyásoljuk. Az expressziós plazmid megszerkesztéséhez célszerűen a Serratia marcescens triptofán operonjának irodalomból ismert [Miozzari és 40 Yanofsky: Nature, 276, 684-689 (1978)] nagyon erős és szabályozható alábbi formulájú promoter/operátor rendszerét alkalmazzuk: 5’ AATTCACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACTTTGCCTTC 3’ GTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGAAACGGAAG IC-----—promoter----------------------------GCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCAACGG CGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGTTGCC ------------promoter/operátor-------------------------------> Ezt a szekvenciát az irodalomból ismert módon állíthatjuk elő. 55 A riboszómakötő szekvencia RBS szerkesztése Ez esetben az az 12mer 5’ TAAGGAGGTTTA 3’ ATTCCTCCAAATTCGA 6MER 10MER 5’TAAGGAGGTTTA 60 szerkezetű riboszómakötő szerkesztése előnyösen úgy történik, hogy az alábbi 3 szinformulájú, különlegesen hatékonynak leirt tetikus oligonukleotidot szekvenciát alkalmazzuk [Jay és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 5543-5548 (1981)]. 65 4
