202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
HU 202275 A szintézis egy fajlagos primer jenek alkalmazáséval helyettesítjük. A 4. számú, 16-mer prímért: S'-TATTGCTGCAGTCGAG, szintetizáljuk, hogy üzenetérzékeny szekvenciát képviseljen egy PstI helyen, körülbelül 400 bázispár távolságra az A. exon 3’ végétől felfelé (9. ábra). Az mRNS-t reverz átírásnak vetjük alá oligo (dT) beindítással, hozzáadjuk a 4. számú prímért DNS polimerázzal együtt a második szál szintéziséhez, majd az EcoRI-hez adaptált cDNS-t a lambda GT10-be ligáljuk, amint ezt fentebb leírtuk. Három millió tarfoltot vetünk alá szűrővizsgálatnak egy 419 bázispárból álló Pstl/HincII töredék segítségé vei, amely p3.12-n helyezkedik el. Ez a töredék a 4. számú primertöl lefelé (.downstream') van. A kinyert négy klónból DNS-t állítunk elő. Ezeket emésztjük és feltérképezzük restrikciós enzimekkel, és folthibridizációt végzünk velük további olyan, lefelé levő genomikus töredékek segítségével, amelyeket éppen korábban azonosítottuk mint exonokat, SV40 exon-kifejezö plazmidok alkalmazásával, amiért fentebb leírtuk. A négy rekombináns közül három hibridizál. A leghosszabb, a lambda 10.44, közelítőleg 1800 bázispárból áll. A lambda 10.44 DNS szekvenciája azt mutatja, hogy a második szál szintézise valóban a 4. számú prímeméi kezdődik. Ez az összes exon-szekvenciát tartalmazza, amely az S36 SV40 exon kifejező kiónban megtalálható, és még továbbiakat is magában foglal. A lambda 10.44 nyitott leolvasó kerete azonban a cDNS végéig folytatódik. Sem lefordíthatatlan 3’ tartományt, sem poli(A) farkat nem találtunk. Feltehetően a második szál szintézise nem fejeződik be teljességig. Annak érdekében, hogy megtaláljuk a teljes 3’ végződést tartalmazó kiónokat, ismételt szűrővizsgálatnak vetjük alá ugyanezeket a szűrőket a lambda 10.44-ből származó jelzett DNS-sel. 24 további kiónt nyerünk ki és térképezünk fel. A két leghosszabb klón (lambda 10.3 és lambda 10.9.2) szekvenciáját meghatározzuk. Ezek lényegében azonos szekvenciákat tartalmaznak, amelyek átfedi a lambda 10.44 kiónt, és körülbelül 1900 bázispárral többet tartalmaznak a 3’ felé. 51 bázispárral lambda 10.44 terminális végén túl a DNS szekvencia egy TGA leforditás-megállitó kodont mutat, amely után egy 1805 bázispárból álló, látszólag leforditatlan 3’ tartomány következik. Ezt a tartományt a következők jellemzik: mind a három leolvasókeretben elosztott megállító kodonok és egy poli(A) jel szekvencia, AATAAA [Proudfoot és munkatársai, Nature, 252, 359 (1976)], majd 15 bázis következik lefelé egy poli(A) kinyúlással a cDNS végénél (a lambda 10.3 klón 8 A-t tartalmaz, amelyet az EcoRI adapter követ ezen a ponton, mig a lambda 10.9.2 klón több, mint 100 A-t tartalmaz a 3’ végénél). 5 J d. A Leljen cOAS szekvencia Az egymástól átfedő kiónok teljes szekvenciáját a 10. ábrán mutatjuk be. Ez egy folytonos nyitott leolvasókeretböl áll, amely 2351 aminosavat kódol. 19 aminosavból álló terminális jelpeptidet tételezve fel, az .érett'fehérje 2332 aminosavat tartalmaz. Ennek a fehérjének a számított molekulatömege körülbelül 267.000 dalton. Figyelembe véve a lehetséges glikozilezódést, ez megközelíti a természetes fehérje molekulatömegét, amint azt nátrium-dodecil-szulfátos poliakrilamidgél elektroforézissel meghatározzuk. A .teljes" cDNS hosszúsága, amely körülbelül 9000 bázispár a 3’ poli(A) hosszúságától függően, megegyezik az mRNS Northern-féle folthibridizációval meghatározott hosszúságával. Az amino végcsoportot kódoló 5’ tartomány lényegében megfelel a Vili. faktor 210 kD molekulatömegű származéka peptidszekvenciájának, s a karboxil végcsoportot kódoló 3’ tartomány gyakorlatilag megfelel a 80 kD molekulatömegü fehérje peptid szekvenciájának. 8. A rekombináns Vili. faktor kifejezése a. A teljes bosszúságú klón összeállítása Annak érdekében, hogy kifejezzük a rekombináns Vili. faktort, a teljes 7 kb nagyságú fehérjekódoló tartományt összeállítjuk több különálló cDNS- és genomikus kiónból. Az alábbiakban és a 11. ábrán ismertetjük három közbülső plazmid szerkezetét. Ezek a gén 5’, középső és 3’ tartományát tartalmazzák. A közbülső plazmidokat egy kifejező plazmidban egyesitjük egy SV 40 korai promotor után. Ez a plazmid viszont kiindulási pontul szolgál olyan különféle szerkezetek kialakításához, amelyek módosított terminálisszekvenciákat, eltérő promotorokat és kiválasztható jelzőket (markereket) tartalmaznak különféle emlős sejtek transzformálásához. Az 5’ kódoló tartományt olyan módon állítjuk össze egy pBR322 származékban, hogy egy Claí restrikciós helyet helyezünk el a VIII. faktor jel szekvenciájának ATG start kódonja elé. Mivel más Claí hely nem található a génben, ez alkalmas helyet képez a kifejező plazmid finomításához. Az alkalmas Claí és SacI helyeket tartalmazó pT24-10 plazmidot [Capon és munkatársai, Nature, 301, 33 (1983)] HindlII enzimmel hasítjuk, DNS polimerázzal betöltjük, és SacI enzimmel elhasitjuk. Egy 77 bázispárból álló AluI/SacI töredéket nyerünk ki a VIII. faktor lambda cDNS kiónja 5’ tartományából, és ebbe a vektorba ligáljuk. Ilyen módon a pF8Cla-Sac jelölésű közbülső plazmidot kapjuk. (Az Alul hely a VIII. faktor 5’ lefordi-52 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 G5 28
