202275. lajstromszámú szabadalom • Eljárás funkciónális humán VIII. faktor előállítására
19 HU 202275 A 20 A replikációs origó vagy a vektor olyan jellegű felépítésével biztosítható, hogy egy exogén origót biztosítson (ilyen az adenovírusból vagy más virusforrásból, például polioma, SV40, VSV, BPV stb. vírusokból származhat), vagy a gazdasejt kromoszomális replikációs mechanizmusa biztosíthatja, ha a vektor beépül a gazdasejt kromoszómájába. Amikor kiválasztunk egy előnyös gazdasejtet, a találmány szerinti olyan vektorokkal való álfertőzéshez, amelyek mind a VIII. faktort, mind a DHFR fehérjét kódoló DNS szekvenciákat tartalmazzák, célszerűen az alkalmazott DHFR fehérje típusa szerint választjuk ki a gazdasejtet. Abban az esetben, ha vad típusú DHFR fehérjét használunk, előnyös olyan gazdasejt választása, amely DHFR-ben hiányos. Ez lehetővé teszi ugyanis azt, hogy a DHFR kódoló szekvenciát jelzőként használjuk a sikeres átfertözéshez olyan szelektív táptalajon, amelyből hiányzik a hipoxantin, glicin és a timidin. Másrészt, ha szabályozó szekvenciaként olyan DHFR fehérjét használunk, amelynek csekély a megkötő affinitása az MTX iránt, akkor nincs szükség a DHFR-rezisztens sejtek alkalmazására. Tekintettel arra, hogy a mutáns DHFR rezisztens a metotrexátra, az MTX-tartalmú táptalajok felhasználhatók a kiválasztás eszközeként, feltéve, hogy maguk a gazdasejtek érzékenyek metotrexátra. A legtöbb eukarióta sejt, amely képes MTX-et abszorbeálni, metotrexát-érzékeriy. Úgy is eljárhatunk, hogy vad típusú DHFR gént alkalmazunk erősítő jelzőként olyan gazdasejtben, amely nem hiányos DHFR-ben, feltéve, hogy egy második szelekciós markert is alkalmazunk, például a neomicinnel szembeni i-ezisztenciát. A leírás egy későbbi részében közolt példák BHK sejtek, mint gazdasejtek alkalmazását ismertetik, és olyan kifejező vektorok használatát, amelyek tartalmazzák az adenovirus fő késői promotorát. C. Általános módszerek Ha vastag, sejtfalnélküli, sejteket használunk gazdasejtként, az átfertózést a kalcium-foszfátos kicsapásos módszerrel végezzük [Graham és munkatársai, Virology, 52, 546 (19781). Más módszereket is alkalmazhatunk azonban a DNS sejtekbe történő bevitelére, például magba fecskendezést vagy protoplasztfúziót. Ha prokariota sejteket vagy olyan sejteket használunk, amelyek tekintélyesebb sejtfalszerkezeteket tartalmaznak, az az átfertözés előnyös módszere a kalciumos kezelés kalcium-klorid alkalmazásával [Cohen és munkatársai, PNAS (USA), 69, 2110 (1972)]. A kívánt kódoló és szabályozó szekvenciákat tartalmazó alkalmas vektorok felépítéséhez szokásos ligálásos módszereket használunk. Az elkülönített plazmidokat vagy DNS töredékeket elhasítjuk, a végeket megfelelőre szabjuk, és újra ligáljuk olyan formában, amely a kívánt plazmidok létrehozásához szükséges. Az elhasitást restrikciós enzimmel (vagy enzimekkel) történő kezeléssel végezzük, alkalmas pufferoldatban. Általában mintegy 1 pg plazmidot vagy DNS töredéket kezelünk 1 egység enzimmel körülbelül 20 pl pufferoldatban 1 órán át. (Az egyes restrikciós enzimekre a gyártók megadják az alkalmas pufferoldalokat és a szubsztrátum mennyiségeit. Hasonló módon, a gyártó cégek rendelkezésére bocsájtják a T4 ligáz, T4 polinukleotid kinéz és a bakteriális lúgos foszfatáz alkalmazásának szokásos körülményeit.) Inkubálás után a fehérjét fenollal és kloroformmal végzett extrakcióval eltávolítjuk, a nukleinsavat pedig etanolos kicsapással nyerjük ki a vizes frakcióból. A szokásos laboratóriumi eljárások ismertetése rendelkezésre áll [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982). A .tapadós végű" (átfedő) restrikciós enzimtöredékek .tompa végű' töredékekké válnak például a következő módszerek alkalmazásával. Betöltés párképzéssel: 2-15 Mg DNS-t 24 °C-on 30 percig inkubálunk egy olyan oldatban, amely a következőket tartalmazza: 50 mM nátrium-klorid, 10 mM trisz (pH=7,5), 10 mM magnézium-klorid, 1 mM ditiotreitol, a négy dezoxinukleozid-trifoszfát 250-250 mikroM koncentrációja és 8 egység DNS polimeráz Klenow-töredék. A reakciót fenolos és kloroformos extrakcióval és etanolos kicsapással fejezzük be. Emésztés SÍ nukleázzal: 2-17 p& DNS-t 600 egység Sí nukleázzal inkubálunk 37 °C-on 30 percig egy olyan oldatban, amely 25 mM nálrium-acetálot (pH=4,5), 1 mM cink-kloridot és 300 mM nátrium-kloridot tartalmaz. Ezután extrakciót végzünk fenollal és kloroformmal, majd etanolos kicsapást hajtunk végre. Szintetikus DNS töredékeket készítünk az ismert foszforsav-triészteres [Crea és munkatársai, Nukleic Acids Res., 8, 2331 (1980) j vagy foszforamidites módszerekkel [Beaucage és munkatársai, Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)). A DNS-t elektroforézisnek vetjük alá agaróz vagy poliakrilamid gélen a szokásos módszerekkel [Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). A töredékeket elektroelúcióval tisztítjuk a gélről [Lawn és munkatársai, Nucleic Acids Res., 9, 1045 (1981) ]. Ezután a DNS-sel Southern-folt hibridizációt végzünk [Southern, J. Molec. Biol., 98, 503 (1975)]. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 00 05 12
