202274. lajstromszámú szabadalom • Eljárás BepI restrikciós endonukleáz előállítására Brevibacterium epidermidisből
1 HU 202274 B 2 A találmány tárgya eljárás új BepI restrikciós endonukleáz előállítására Brevibacterium epidermidisböl. A restrikciós endonukleázok azon enzimek, melyek a kettősláncú DNS-ben bizonyos, rájuk jellemző szekvenciákat felismernek, majd endonukleolitikusan mindkét láncot hasítják. Mai tudásunk szerint restrikciós endonukleázok csak prokarióta szervezetekben, azaz baktériumokban és kékalgákban keletkeznek, itt viszont elég gyakoriak. Az eddig ismert restrikciós endonukleázok száma meghaladja a 400-at. Különböző eredetű és szerkezetű enzimek végezhetnek azonos funkciót - ún. izoszkizomer enzimek, igy a felismerési specifitás az enzimek nagy száma mellett is kevesebb, mint 100 féle. Az enzimes bontások egy részénél az enzim a két láncot szemben, azonos helyen vágja el .tompa' véget eredményezve. Egy másik csoportnál az enzim a két láncot aszimmetrikusan vágja el, igy 3’vagy 5’- túlnyúló .ragadós' vég keletkezik. A restrikciós endonukleázok felismerő szekvenciája gyakran ún. palindrom, azaz olyan DNS szakasz, amely leolvasás-szimmetrikus, az egyik szál bázissorendje a komplementer szál megfelelő darabján visszafelé olvasva azonos, például CTGCAG GACGTC A restrikciós endonukleázok ma már nélkülözhetetlen eszközei az elméleti és alkalmazott genetikai kutatásnak, emellett jelentőséget nyertek minden olyan azonosító, minősítő, diagnosztikai módszerben, ahol a vizsgálat alapja a DNS jellemző szerkezetének, vagy egy jellemző részének a kimutatása. Természetesen annál szélesebb az alkalmazás köre, minél nagyobb a választék a specifikusan felismert szekvenciákban. Az említett, kb. 100 féle szerkezetet az esetek egy részében olyan enzimek ismerik fel, melyek általánosan előforduló, jól tenyészthető baktériumokból megfelelő mennyiségben előállíthatok. Más szerkezeti változatok felismerhetósége és hasithatósága elvi jelentőségű maradt, mert a specifikus enzim gyakorlatilag nem, vagy rendkívül nehezen termelhető. Ilyenkor jelentős műszaki haladást képvisel egy olyan izoszkizomer enzim felismerése, mely már gyakorlati alkalmazhatóságot ígér. A CGCG palindromot felismerő enzimek alaptípusa elég ritka és különleges enzim, eredete miatt. Ezt az enzimet egy obiigát anaerob, patogén mikroorganizmusban mutatták ki (Nucleic Acid. Res., 6, 1-15, 1979), és a törzs után - Fusobacterium nucleolatum - FnuDII-nek nevezték. Ismertté vélt egy iparszérűén előállítható másik izoszkizomer változat is (Nucleic Acid Res., 5, 1729-1739, 1978) Thai néven, azonban ennek termelője extrém módon termofil, és pH=0,7-2,0 között szaporítható. A törzs Thermoplasma acidophilum. Kutatásaink sorén azt találtuk, hogy egy gyakran előforduló, jól tenyészthető és ellenálló baktériumfaj képes a FnuDII enzim izoszkizomerjét előállítani. Az enzim, melyet Bepl-ként jelölünk, magas hozammal kinyerhető. A törzset Brevibacterium spidermidis-ként azonosíthattuk, egyszerű táptalajon 50 perces generációs idővel jól szaporítható. A törzset a Mezőgazdasági és Ipari Mikroorganizmusok Nemzeti Gyűjteményében MIMNG (NCAIM B) P 001019 számon deponáltuk. A találmány szerint úgy járunk el, hogy Brevibacterium epidermis MIMNG (NCAIM B) P 001019 törzset vagy annak BepI enzimet termelő mutánsát vagy variánsát asszimilálható szén-, nitrogénforrást és ásványi sókat tartalmazó táptalajon süllyesztett, aerob körülmények között tenyésztünk, majd a sejttömegből kinyerjük a kívánt enzimet. Az 1. és 2. ábra magyarázatát a példákban adjuk meg. Az enzim előállításának néhány lehetséges módját mutatjuk be az alábbi példákban. 1. példa Brevibacterium epidermidis MIMNG (NCAIM B) P 001019 számú törzset 6 havonkénti átoltással tartunk fenn YTA táptalajon. A ferde agar tenyészetről kacsnyi mintával beoltunk kémcsőben sterilezett 7 ml YTB táptalajt, ebben a baktériumokat egy éjszakán át tenyésztjük. A tenyészettel 1 liter YTB táptalajt oltunk 3 literes Erlenmeyer lombikban, melyet rázatással (350 rpm) 27 °C-on 22 órán át inkubálunk. A fermentléból a baktériumokat centrifugálással (4000 rpm 30 perc) leválasztjuk, így 62 g fuganedves sejtet nyerünk. Ebből 50 g-os mintát az alábbi szerint dolgozunk fel: A sejtmasszához 100 ml, 0,01 M pH=7,4 Tris-HCl puffert adunk, mely 0,01 M 2-merkapto-etanolt tartalmaz. A sejteket ultrahanggal feltárjuk (a készülék Sonifer Cell Disruptor, a feltárás ideje 10 perc, 50%-os munkaidővel). A sejttörmeléket 60 perces ultracentrifugálással (35 000 rpm) távolitjuk el. A felülúszóhoz 1M koncentrációig NaCl-ot adunk és a nyers kivonatot 4x90 cm-es Bio-Gel A -0,5 m oszlopon történő kromatografálással tisztítjuk. "Az alkalmazott eluens 1M NaCl-tartalraú 0,01 M pH=7,4 Tris-HCl puffer, 0,01M 2-merkapto-etanol adalékkal. Az enzimaktivitást mutató frakciókat egyesítjük. Az enzimaktivitás vizsgálata a következő: 10 pl 0,01M pH=7,4 Tris-HCl pufferhez 0,01M MgCl-ot és lmM ditiotreitolt, valamint 1 pg lambda fág DNS-t adunk. A rendszerhez 2 pl mintát mérve azt 30 °C-on 60 percig inkubáljuk. A DNS bontási reakciót 3 pl leállító pufferral leállítjuk, melynek összetétele 50% 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
