202250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202250 B 2 diens eluálást végzünk 1,30 cm/perc átfolyási sebességgel, 100-100 ml (A) és (B) oldattal, ahol a (B) oldat mennyisége 0-tól 100%-ig változik. (A) : 0,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0), (B) : 1,0 mól/1 NaCl/10 mmól/1 tris-HCl (pH-7,0). A retenciós időt HPLC gélszűrssel a fenti, (5-2) lépés szerinti módon mérjük, amely 21,35±0,2 percnek adódik. Az L-poli(C20,S4U) terméket, amelynek bázisszáma 100-1000, 90%-os kitermeléssel kapjuk. (6) Temper álás (6-1) L-poli-I és L-poli-C 3,0 g (5-2) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli-C-t és 3,2 g, (5-1) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli-I-t külön-külön feloldunk 150 ml 10 mmól/l-es tris-HCl puffer (pH=7,5)/50 mmól/l-es NaCl elegyben, és jól elkeverjük. A kapott oldatot vízfürdőn 70 °C-ra melegítjük, és ezen a hőmérsékleten tartjuk 10 percig. Ezután hagyjuk lehűlni, és egy éjszakán át állni. A fenolos kezelést, etanolos kicsapást és a dializálást a (4) példa szerinti módon végezzük. így 6,2 g temperált vegyületet kapunk. (6-2) L-poli-I és L-poli-(C20,S4U) 1,46 g, (5-4) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli- (C2o,S4U)-t és 1,57 g (5-1) lépés szerinti módon kapott, méretezett L-poli-I-t a fenti, (6-1) lépés szerinti módon kezelünk, és így 3,0 g temperált terméket kapunk. Biológiai vizsgálatok (1) Interferon indukáló aktivitás A találmány szerinti eljárással előállított, kénezett poli- C.poli-I származék interferon indukáló aktivitását vírusellenes aktivitási vizsgálat módszerével határozzák meg. Az I. vizsgálati minta kénezett poli-C.poli-I volt, amely 50-2000 maradékból állt és kénezésaránya n-20 volt. Humán perifériás vérből nyert limfocitákat (106 sejt/ml) tenyészközegben (RPMI1640; 20% FCS) 2 óra hosszat kezeltünk a mintával (10 jig/ml). Ezután a tenyészközeget friss közegre cseréltük (RPMI 1640; 20% FCS), 20 óra hosszat inkubáltuk, és a felülúszót szokásos interferon- vírusellenes aktivitás-mérési módszerrel mérjük, Sindbi-vírus és Fl-sejtek alkalmazásával [v.ö. Rinsho Kensa, 28, 1726, (1984)]. Az eredményeket a következő táblázatban foglaltuk össze. Az interferon-titert CPEI 50 (Cytopathogenic Effect Inhibition 50) hígítási érték formájában mértük. Kontroll mintaként kereskedelmi poli-I.poli-C mintát használtunk. Interferon titer (egység/ml) 0 £ 1 100 jrg/ml 200 Jig/ml 500 Jig/ml I. vizsgálati minta 100 >6400 >6400 >6400 Kontroll minta 100 800 1600 >6400 Amint látható, a találmány szerinti nukleinsavszármazék erős interferon-indukáló hatással rendelkezik. A találmány szerinti ejárással előállított, kénezett poli-C.poli- I nukleinsavszármazékok közül egy 50-300 maradékot tartalmazó, n-20 arányban kénezett származék, egy 200-2000 maradékot tartalmazó, n=20 arányban kénezett származék, valamint egy 20000- nél több maradékot tartalmazó, n-20 arányban kénezett származék hasonló eredményeket adott. (2) TNF (Tumor Necrosis Factor) indukáló aktivitása Nyulakból, amelyeket 10-14 nappal korábban BCG-vel kezeltünk, alveoláris makrofágot vettünk, 10% FCS-t tartalmazó RPMI 1640 tápközeggel 2.106/ml-re állítottuk be. Ebből 1-ml-t műanyag edénybe helyeztünk, és 5% C02-t tartalmazó légtérben 37 °C- on a minta jelenlétében vagy anélkül inkubáltuk. A sejttenyészet felülúszóját 2 és 8 óra múlva TNF aktivitási tesztnek vetettük alá. Az eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza. A TNF aktivitási titer a 72 óra múlva LM sejtekre kifejtett 50%-os sejtgátló aktivitáshoz tartozó hígítási érték, festékfelvevő módszerrel meghatározva. Azt, hogy a sejtgátlást a TNF okozza, nyúl TNF elleni monoklonális antitest aktivitás semlegesítésével igazoltuk. TNF aktivitás Semlegesítés 2 óra 8 óra anti-TNF antitesttel KontrollLPS (1 Jig/ml) 32 64 + I. vizsgálati minta (10 jig/ml) 32 64 + Kontroll minta (10 jig/ml) 32 64 + LPS: lipopoliszacharid A „kontroll” fiziológiás sóoldat volt, a kontroll minta ugyanaz, mint az előző vizsgálatban. Látható, hogy a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazék TNF indulkáló aktivitása erős. (3) Tumorsejt szaporodási gátló hatás A VII. vizsgálati minta egy 50-10000 maradékot tartalmazó n=20 arányban kénezett, találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazék. A minta inhibitor hatását vizsgáltuk, amellyel egerekben a rák elburjánzását gátolja. A vizsgálati eredményeket az alábbi táblázat tartalmazza. Egerek száma Átlag+S.E. Gátlás % Kontroll 10 2,64±0,21-VII. vizsgálati 10 1,93±0,23 27 minta (100 jig/egér) Az eredmények azt mutatják, hogy a találmány szerinti eljárással előállított nukleinsavszármazék szaporodást gátló hatást mutat tumor sejtekre rákos egerekben. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
