202250. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavszármazékok és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202250 B 2 A találmány tárgya eljárás nukleinsavak és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására. A nukleinsavak purinból vagy pirimidinből, a gyűrűhöz kapcsolódó ribózból vagy más cukorból állnak, és ezeket az alapelemeket foszfátcsoportok kötik össze, láncszerű szerkezetet alkotva. A nukleinsavak közül az RNS (ribonukleotid polimer) olyan láncszerkezetű makromolekuláris vegyület, amely cukorrészként ribózt tartalmaz, és amelyben a cukorrészek foszfátcsoportokon keresztül diészter kötésben kapcsolódnak egymáshoz. A kétszálú nukleinsavakban a nukleinsavat alkotó bázisok (például inozin, adezozin, citidin, uridin, stb.) purin vagy pirimidin gyűrűit úgynevezett komplementer hidrogénkötések kötik össze kettős hélix térbeli szerkezetet alkotva. Mivel feltételezik, hogy a kettősszálú szerkezettel rendelkező nukleinsavak hasznos fiziológiai szerepet játszanak, számos tanulmányt végeztek az ilyen nukleinsavakon (Biochemical and Biophysical Research Communications 58, 1974, stb.). Az ilyen típusú nukleinsavak közül a szintetikus, kettősszálú RNS-t, a poliinozinsav-policitidinsav-származékot a továbbiakban „poli-I.poli-C” kifejezéssel jelöljük. A poliinozinsavat, amely ennek a származéknak alapvető alkotóeleme, „poli-I” kifejezéssel, míg a politicitidinsavat „poli-C” kifejezéssel jelöljük. Számos olyan természetes és szintetikus kettősszálú RNS-t ismerünk, amelyek interferon-indukáló hatással rendelkeznek [Field et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 58, 1004, 1967; Field et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 58, 2102, 1967; Field et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 61, 340, 1968; Tytell et al, Proc. Nat. Acad. Sei., U.S., 58, 1719, 1967; Field et al, J. Gen. Physiol., 56, 905, 1970; De Clercq et al, Methods in Enzymology, 78, 291, 1981], Jellegzetes szintetikus nukleinsavszármazékok például a következők. Interferon indukáló szintetikus nukleinsavszármazékok (I) Homopolimer.homopolimer-komplexek (kettősszálú nukleinsav- polimerek, amelyek poli-I.poli-C szerkezettel rendelkeznek): (1) Bázismódosított származékok: poliinozinsav.poli(5-bróm-citidilsav), poliinozinsav.poli(2-tiocitidilsav), poli(7-dezazainozinsav).policitidilsav, poli(7-dezazainozinsav).poli(5-bróm-citidilsav). (2) Cukormódosított származékok: poli(2’-azidoinozinsav).policitidilsav. (3) Foszforsavmódosított származékok: poliinozinsav.poli(citidin-5’-tiofoszforsav). (II) Intermódosított kopolimerek: poli(adenilsav-uridilsav) (ül) Homopolimer.kopolimer-komplexek: poliinozinsav.poli(citidilsav-uridilsav), poliinozinsav.poli(citidilsav-4-tiouridilsav). (IV) Szintetikus sav/polikation komplexek: poliinozinsav-policitidilsav.poli-L-lizin (a továbbiakban „poli- ICLC”). (V) Mások: poliinozinsav.poli(5-vinil-citidilsav). Amint említettük, az utóbbi években számos kettősszálú RNS-t, különösen poli-I.poli-C egységekből felépülő származékot ismertettek. Ezek közül számos nukleinsavszármazékról feltételezik, hogy összefüggés van a szerkezet és a funkció között (De Clercq és munkatársai, Texas Reports on Biology and Medicine, 41, 77, 1982). Kísérleteink során úgy találtuk, hogy ha poli-I.poli-C és ezek különböző, poli-I.poli-C-maradékot tartalmazó származékainak méretét úgy állítjuk be, hogy a teljes molekula mérete ülepedési konstanssal kifejezve 4S és 13S közé essen (vagy bázisszámmal kifejezve 50 és 10 000 közé essen), akkor az így kapott származék toxieitása lényegesen lecsökken, de még rendelkezik fiziológiai aktivitással (v.ö. 62/167 433 számú japán szabadalmi bejelentés). Különböző módszereket dolgozunk ki a fenti termékek előállítására. Különösen arra vonatkozó tanulmányokat folytattunk, hogy 50-10 000 bázisszámú nukleinsavakat kapunk, és kettősszálú nukleinsav polimereket állítsunk elő két különböző egyszálú nukleinsavból. A nukleinsavszármazékok molekulaméreteloszlásának meghatározott értékhatárok közé történő szűkítését „méretezés” kifejezéssel említjük. Mivel a találmány értelmében a méretezés kisebb molekulaméretű anyagok előállítását jelenti, ez a méretezés magában foglalja a „láncrövidítést”. A „bázispár” (a továbbiakban „bp”) kifejezés, amelyet általánosan a nukleinsavak molekulamérete egységeként használnak, a nukleinsavat alkotó bázisok száma formájában jelöli a nukleinsavak molekula méretét. (Például 10 bp olyan kettősszálú polimert jelent, amely 10 bázisból épül fel.) A jelen leírásban nem csak kettősszálú nukleinsav polimerekről van szó, ezért a „bázisszám (bázisok száma)” kifejezést használjuk a „bp” helyett & nukleinsavak molekulaméretének jellemzésére. (így például egy „10 bázisszámú” nukleinsav polimer azt jelenti, hogy a polimerben 10 bázis található). Amikor a nukleinsavak molekulaméretét kell meghatározni vagy azonosítani, általában széles körben az úgynevezett ülepedési konstanst (S érték) használják. A nukleinsavak említett bázisszáma azonban gyors folyadékkromatográfiával (HPLC) megkapható gélszűrő oszlopon vagy elektroforézissel (a későbbiekben részletesebben) ahol jelzőként ismert molekulaméretű kettősszálú standard DNS-eket (Ml3 fág- DNS fragmenseket) használunk, és a nukleinsav meghatározandó bázisszámát a kontroll bázisszáma alapján számítjuk. A makromolekulás nukleinsavak molekulatömegének jellemzésére mindeddig az ülepedési konstans értéket (S értéket) használták széles körben. A kereskedelemben kapható makromolekulás nukleinsavak jellemzése S értékükkel történik. A kísérleti technikák utóbbi években bekövetkezett fejlődése következtében azonban a gélelektroforézis, gélszűréses kromatográfia, ioncserélő kromatográfia, stb. sokkal pontosabb eszközt biztosít a makromolekulás anyagok molekulatömegének meghatározására, így a makromolekulás nukleinsavak lánchosszának meghatározása lehetővé vált. Ilyen körülmények között az S értékkel való jellemzés és a lánchosszal való jellemzés közötti összefüggés problematikussá válhat. Különösen mivel az illető nukleinsav-molekuláknak az S értékkel történt jellemzés esetén megvan a saját valódi értékük, nem mindig problémamentes annak megállapítása, hogy az S értékkel megadott méret és a lánchosszal meg5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
