202247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleotidok és nukleozidok foszforilezésére

1

HU 202247 B

2

roléterben felvett oldatával elegyítjük 5 °C hőmérsékleten 1 óra alatt. A reakcióelegyet 1 órán keresztül ezen a hőmérsékleten kevertetjük, majd a kiváló amid- hidrokloridot szűrjük, a petrolétert vízsugárvákuumban leszívatjuk és a maradékot vákuum (0,2 mbar) desztilláljuk. 38-41 aC hőmérsékleten főfrakcióként 98 g olajat kapunk, amely hűtőszekrényben (-20 °C) kristályosodik és 99%-os tisztaságú (3IPNMR, 8-170 ppm.)

6. példa

Foszforossav-bisz[2-(p-nitro-fenil)-etil-észter]-diizopropil-amid [(IX) képlet]

16 g (0,1 mól) 2-(p-nitro-fenil)-etanolt 40 ml abszolút tetrahidrofuránban oldva 26 ml (0,15 mól) diizopropil-etil-aminnal elegyítünk és 0 °C hőmérsékletre hűtjük. Kevertetés közben 15 perc alatt 10 g (0,05 mól) foszforossav-diizopropil-amid-dikloridot csepegtetünk hozzá. A reakcióelegyet szobahőmérsékletre hagyjuk melegedni, majd 30 percen keresztül állni hagyjuk. Az amin-hidrokloridot leszűrjük, a szűrőnucsot kevés tetrahidrofuránnal mossuk és az egyesített szűrleteket bepároljuk és eközben szilárd maradékot kapunk. A maradék 1 gramját 70 g Kiesel-géllel töltött oszlopon toluol(n- hexán)trietilamin 7:2:1 eleggyel eluálva kromatográfiásan tisztítjuk. így 0,95 port kapunk, amely 31P-NMR szerint 96% tisztaságú.

3'P-NMR: 5-147,5 ppm

‘H-NMR: P-OCH2CH2- 8-3,85 ppm, m (4)

P-OCH2CH2- 8-2,98 ppm, t (4)

P-N-CH 5-3,5 ppm, m (2)

P-N-CH(CH3)2 5-1,13 ppm, d (12)

Foszforilezési reakció:

5’-foszfát-csoportot tartalmazó egyszálú oligonukleotid kémiai szintézise: Ncol-Linker 5’ pCCATGG 3’. 7

7. példa

M. J. Gait és munkatársai [Nucleic Acids Res. 8, 1081-1096, (1980)] módszerével a 3’-végen álló nukleozidot, jelen esetben tehát a guanozint „controlled pore glass”-on (CPG, Pierce cég) kovalens kötéssel megkötjük a 3’-hidroxi-csoporton keresztül.

Ehhez először a Kiesel-gélt etanol-lehasítás közben 3-(trietoxi-szilil)-propil-aminnal reagáltatjuk, amelynek során Si-O-Si-kötés keletkezik. A guanozint N2- izobutiril-3’-0-szukcinoil-5’-dimetoxi-trietiléter formájában para-nitro-fenil és N,N’-diciklkohexil-karbodiimid jelenlétében a módosított hordozóanyaggal reagáltatjuk, amelynek során a szukcinoil-csoport szabad karboxilcsoportja a propil-amin-csoport amincsoportját acilezi. A következő reakciólépésekben a báziskomponenseket 5 ’-O-dimetoxi-tritil-nukleotid-3 ’-foszforossav-monometil-észter-dialkil-amid vagy-klorid formájában alkalmazzuk, amikor is az adenin N6- benzoil-vegyület, a citozin N4-benzoil-vegyület, a guanin N2-izobutiril-vegyület és az aminocsoport nélküli timin védőcsoport nélkül fordul elő.

Az oligonukleotid-lánc felépítésére szolgáló reakcióciklus:

1 pírtól megkötött guanozint tartalmazó 25 mg polimer hordozót a megadott sorrendben az alábbi reagensekkel kezelik:

a) nitro-metán;

b) 3 t%-os triklór-ecetsav 1,2-diklór-etánban;

c) nitro-metán;

d) acetonitril;

e) 10-20 pmól megfelelő nukleozid-foszfit és 100 pmól tetrazol 0,2 ml vízmentes acetonitrilben (5 perc);

f) 20 t%-os ecetsavanhidrid tetrahidrofuránban 40 t% lutidinnel és 10 t% dimetil-amino-piridinnel (2 perc);

g) acetonitril;

h) tetrahidrofurán 20 t% vízzel és 40 t% lutidinnel;

i) 3 t% jód kollidin/víz/tetrahidrofurán 5:4:1 térfogatarányú elegyben (0,5 perc);

j) acetonitril.

Nuklezidfoszfit alatt jelen esetben dezoxiribóz-3’monofoszforosav-monometil-észtert értünk, amelyben a harmadik vegyértéket klóratom vagy tercieraminocsoport, például morfolinocsoport köti le. Az egyes szintézislépések kitermelését minden esetben a detritilezési reakció (b) után spektrofotometriásán határozhatjuk meg a dimetoxi-tritil-kation abszorpciójának 496 nm hullámhosszon történő mérésével.

Az 5’-hidroxicsoport kémiai foszforilezésére szolgáló reakcióciklust lényegében azonos módon végezzük, mint az előző példákban, azonban azzal a különbséggel, hogy egyrészt az e) pontnál 20 pmól megfelelő foszforilező reagens [például (VI) képletű vegyület] és 100 pmól tetrazolt reagáltatunk 0,2 ml vízmentes tetrahidrofurán/acetonitril elegyben (azonos térfogatarányú elegy) 10-20 percen keresztül, másrészt az f) lépés elmarad és harmadrészt az i) lépés idejét 5 percre hosszabítjuk.

Az oligonukleotid szintézisének befejezése után az oligomer metilfoszfát védőcsoportjait p-tiokrezol és trietil-amin segítségével lehasítjuk. Ezután 3 órán keresztül ammóniával kezeljük és így az oligonukleotidot leválasztjuk a szilárd hordozóról. Ha az oligomert 2-3 napon keresztül koncentrált ammóniával kezeljük, a bázis aminovédőcsoportjai kvantitive lehasadnak.

a) Ha a foszforilező reagensként foszforossav-metilészter-[2-(p- nitro-fenil)-etil-észter]-diizopropil-amidot [(VI) képletű vegyület) alkalmaztunk, a fenti védőcsoport lehasítás után 5’-hidroxicsoportján 2-(pnitro-fenil)-etil-foszfát-csoportot tartalmazó oligonukleotidot kapunk. Ez a foszfátészter fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiásán tisztítható, amelynek során különösen jó eredménnyel elválasztható a hidroxikomponenstől. A p-nitro-fenil-etil-csoport lehasításához az észtert 0,9 mól TBD-vel reagáltatunk piridin/víz 9:1 térfogatarányú elegyében szobahőmérsékleten 8 órán keresztül. Ezután nagynyomású folyadékkromatográfia, illetve 20 t%-os poli(akril-amid)-gélen 2 mólos karbamiddal végzett gélelektroforézis szerint további kiindulási anyag nem marad. A reakcióelegyet 1 ml 2 mólos ecetsavval elegyítjük, és bepároljuk. A maradékot SEPHADEX G 50-nel töltött oszlopon 0,02 mól trietil- ammónium-hidrogén-karbonáttal (pH-7) sótalanítjuk.

A kapott 5’-foszfát-oligonukleotidot polinukleotidligáz segítségével kétszálú repetitív DNA keletkezése közben polimerizálhatjuk, amely Hae III restrikciós enzim segítségével ismét hasítható (felismerőhely: GG/CC).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5