202247. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleotidok és nukleozidok foszforilezésére
1 HU 202247 B 2 a) Foszfor-trikloridot metanollal reagáltatunk bázis jelenlétében, a reakcióterméket diizopropil-aminnal reagáltatjuk, majd bázis jelenlétében 2-(p-nitro-fenil)etanollal reagáltatjuk; b) a foszfor-trikloridot először 2-(p-nitro-fenil)-etanollal reagáltatjuk, majd izopropil-aminnal, végül metanollal reagáltatjuk; vagy c) a foszfor-trikloridot először diizopropil-aminnal, majd 2-(p-nitro-fenil)-etanollal, végül metanollal reagáltatjuk. A (III) általános képletű foszforilező reagens és a hidroxi- vegyület reakcióját vagy oldatban végezzük ekvimoláris mennyiségű, illetve ekvi-feleslegű, például legfeljebb 50 mól%, előnyösen legfeljebb 25 mól% foszforilező reagenssel gyenge sav, így etrazol vagy amin-hidroklorid jelenlétében, vagy szilárd fázisú szintézis formájában végezzük nagy feleslegű foszforilező reagenssel gyenge sav jelenlétében. Ha például a hidroxil-komponenst hordozón megkötjük, a foszforilező reagenst 10-20- szoros moláris feleslegben alkalmazzuk. Ha oldatban dolgozunk, úgy a foszforilező reagenssel és az acilezendő komponenssel szemben inert oldószert használhatunk. A reakciót 0-80 °C közötti, előnyösen 0-50 °C közötti, elsősorban 0-25 °C közötti hőmérsékleten végezzük. A (IV) általános képletű foszforilezett termék az R1 és R2 csoport jelentésétől függően többé vagy kevésbé kifejezett lipofil karakterrel rendelkezik. Ezek a lipofil-vegyületek egyszerű módon elválaszthatók a nem-foszforilezett kiindulási vegyületektől, például kromatográfiával, így reverz fázisú anyagon, például oktadecil-szilil-csoporttal rendelkező kereskedelmi szilikagélen végzett magas nyomású folyadék kromatográfiával. Az R1 és R2 szubsztituenseket az R csoport kémiai természete, vagyis azon vegyületek kémiai természete alapján választjuk meg, amelyekbe a foszfátcsoportot be kell építeni. Az R szubsztituens további foszforilezhető H-Z-csoportot nem tartalmaz. Ez alatt azt kell érteni, hogy a (III) általános képletű foszforilező reagens viszonylag aspecifikus módon acilez, és így a kívánt foszforilezés érdekében az adott esetben előforduló minden további foszforilezhető Z-H-csoport hidrogénatomját megfelelő védőcsoporttal kell ellátni. A foszforilezhető kifejezés alatt olyan Z-H- csoportot értünk, amely az adott acilezési körülmények között reakcióképes, a szférikus gátlás vagy reakcióképességében inaktiváló csoporttal befolyásolt Z-H-csoportokat tehát nem kell védeni. Mivel az R1 és R2 csoportokat a foszfát-csoportok felszabadítása érdekében a legtöbb esetben bázis segítségével lehasítjuk, az R1 és R2 csoportokat, valamint a felhasznált bázist az R csoport érzékenysége határozza meg. Az R csoport megfelelő stabilitása esetén a lehasítás elvégezhető alkáli-lúggal, ami szélesíti a válsztható R1 és R2 csoportok skáláját. Ér„ zékeny R csoport esetén önmagában ismert kíméletes reakciókörülmények között kell dolgoznunk, például nem-vizes közegben megfelelő bázis, például a fent idézett irodalomban említett DBU felhasználásával. Az R1 és R2 csoportok lehasítását önmagában ismert módon végezzük: Foszfát-triészterből metilcsoport lehasítható tiofenol vagy tiokrezol segítségével bázis, így trietil-amin jelenlétében. A reakciót célszerűen 0-80 °C közötti, előnyösen 0-60 °C, elsősorban 0-30 °C és +30 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Elektronegatív szubsztituenst tartalmazó etilcsoportok eltávolíthatók nem-nukleofil-bázissal is, amelyeket előzőén polimer hordozón megkötnek. Ezt a reakciót célszerűen 0- 80 *C közötti, előnyösen 0-50 *C közötti, elsősorban 0-30 °C közötti hőmérsékleten végezzük. Az elektronegatív szubsztituenst hordozó etilcsoportok az (V) általános képletű vegyületből, célszerűen az alábbi bázisokkal távolíthatók el, amelyeket csökkent reaktivitás sorrendjében adtunk meg: a) (VH) általános képletű ciklikus foszforsav-triamid-imid, amelyben R“, R12 és R13 jelentése azonos vagy különböző, és lehet rövidszénláncú alkilcsoport, előnyösen metilcsport vagy etilcsoport és A és A’ 2—4 szénatomos rövidszénláncú alkiléncsoport, előnyösen 1,3-propilén-csoport; b) l,5,7-triaza-biciklo(4,4,0)dec-5-én (TBD), valamint 7-metil-1,5,7-triaza-biciklo(4,4,0)dec-5-én; c) l,5-diaza-biciklo(4,3,0)non-5-én (DBN), DBU, valamint rövidszénláncú alkálifém-alkoholátok, előnyösen nátrium- alkoholátok vagy kálium-alkoholátok, így nátrium-metilát, nátrium-etilát vagy kálium-tercbutilát; d) 1,1,3,3-tetrametil-guanidin. Az R1 helyén és adott esetben R2 helyén is ß-ciano-etil-csoportot tartalmazó vegyületek hasíthatók ammóniával, ezért ezeket ott alkalmazzuk, ahol a többi védőcsoport ammóniával lehasad. A találmány szerinti eljárás előnye, hogy érzékeny vegyületek foszforilezését is lehetővé teszi. Mint az R1 és R2 csoportok bázissal végzett hasításánál bemutattuk, a találmány szerinti eljárásnál számos megvalósulási mód lehetséges, így az egyes reakciólépések az R csoporton keresztül további reakciókkal koordinálhatók. Ez nemcsak az R1 és R2 lehasításánál igaz, hanem ugyanúgy érvényes az oxidációs reakcióra is, és kívánt esetben egynél több foszfátcsoport bevitelénél is. A találmány szerinti eljárás további lényeges előnye, hogy nemcsak foszfátcsoport, hanem tio- és szeleno-foszfátcsoport bevitelét is lehetővé teszi. így egyszerű módon természetes anyagoknak olyan kémiai analógjai állíthatók elő, amelyek például F. Himmelsbach és munkatársai által kidolgozót eljárással nem hozzáférhetők. A (IV) általános képletű vegyületek (V) általános képletű foszfátokká történő oxidációját analóg vegyületek esetében ismert módon végezzük. Oxidálószerként felhasználható például dinitrogén-tetroxid vagy jód, előnyösen azonban peroxidok, elsősorban vízmentes terc-butil-hidroperoxid. A reakciót előnyösen mérsékelten poláros oldószerben, például nitrilekben, így acetonitrilben vagy halogénezett, elsősorban klórozott rövidszénláncú szénhidrogénekben, így kloroformban végezzük. A reakciót célszerűen 0-80 "C közötti, előnyösen 0-60 *C közötti, elsősorban 0-30 °C közötti hőmérsiékleten végezzük. Az X helyén kénatomot vagy szelénatomot tartalmazó (V) általános képletű vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy a (IV) általános képletű vegyületeket közvetlenül elemi kénnel vagy szelénnel reagáltatjuk. Poláros oldószerben, így tetrahidrofuránban végzett kevertetésnél sztöchiometrikus mennyiségű kénnel vagy szelénnel jó kitermeléssel kapjuk a megfelelő 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
