202245. lajstromszámú szabadalom • Eljárás a mitomicin (foszfono-oxi-alkil)-származékai és e vegyületeket tartalmazó gyógyászati készítmények előállítására
1 HU 202245 B 2 Ha a hatóanyagokat intraperitoneálisan két azonos dózisban adagoltuk úgy, hogy a második dózist az első dózis után 4 nappal adtuk, akkor a (Ha) képletű vegyidet LDso-értéke 45 mg/testsúly-kg-nak, az (V) képletű vegyidet LDso-értéke 90 mg/testsúly-kg-nak adódott. Azt találtuk továbbá, hogy jelentősen több hatóanyagot tudtunk adagolni kisebb dózisok hosszabb időn át történő alkalmazásával. Négy azonos dózisban, 25 nap alatt az állatok 40 mg/kg (Ila) képletű vegyidet, illetve 100 mg/kg (V) képletű vegyidet adagolását tűrték. E vizsgálataink arra utalnak, hogy - a csekélyebb toxicitás következtében - az állatok lényegesen több „prodrug” adagolását képesek elviselni. Az (V) és (Ha) képletű vegyületek, valamint a mítomicin-C citotoxicitását a H2981 emberi tüdődaganat-sejttörzs alkalmazásával határoztuk meg. Úgy jártunk el, hogy 10% borjúmagzatszérumot tartalmazó Iscove-közegben szuszpendáltuk a H2981 sejteket, és az így kapott sejtszuszpenziót 96 üreget tartalmazó mikrotitráló lapra oltottuk (üregenként 10000 sejtet). Egy óra múlva a közeget eltávolítottuk, hozzáadtuk a 7,2 pH-értékű foszfáttal pufferolt konyhasóoldatban oldott hatóanyagot, és 37 °C hőmérsékleten 1 órán át inkubáltuk. Ezután a sejteket kétszer mostuk, az inkubálást 17 órán át folytattuk, majd 3H-tirozinnal kezeltük (üregenként 1,0 pCi). A lemezeket a sejttömeg leválasztása végett -70 'C-ra fagyasztottuk, és a sejteket üvegrostból készült szűrőkorongokra gyűjtöttük. A szűrők radioaktivitását Beckman 3701 típusú szcintillációs számlálóban határoztuk meg. A 3H-tirozin beépülésének a gátlását a citotoxikus hatás jelének tekintettük. Eredményeinket a 2. ábra mutatja; látható, hogy mind a mitomicin- C, mind a (Ila) képletű vegyület erősen citotoxikusak, és IC50 értékük 1 pM-hoz közel áll. Az (V) képletű foszfát esetében csak csekély citotoxikus hatást figyeltünk meg; ha viszont az (V) képletű vegyületet alkálikus foszfátáz-enzimmel előkezeltük, akkor a kapott termék citotoxicitása a (Ila) képletű vegyület és a mitomicin-C citotoxicitásához volt hasonló. A daganatgátlásnak az a módszere, hogy egy (IV) általános képletű vegyület daganatgátló hatás szempontjából hatékony mennyiségét a daganatos állatnak beadagoljuk. Erre a célra a hatóanyagot a szokásos utakon - például intravénás, intramuszkuláris, intratumorális, intraarteriális, intralimfatikus és orális úton - adagolhatjuk. Az e területen jártas szakember az adott emlős gazdaállat esetére legmegfelelőbb adagokat és adagolási rendet könnyen megállapíthatja. Nyilvánvaló, hogy az adag a formulázott gyógyszerkészítmény tíőusától az alkalmazott vegyülettől, az alkalmazási módtól és az alkalmazási helyétől, valamint a kezelendő gazdaállattól és annak betegségétől függ. Számos olyan tényezőt kell figyelembe venni, amelyek módosítják a hatóanyagok hatását, ilyen tényező például az életkor, testsúly, nem, étrend, az adagolás ideje, az adagolás módja, a kiválasztás sebessége, a beteg állapota, gyógyszerkombinációk, a beteg esetleges érzékenysége és betegségének súlyossága. A találmány azon gyógyászati készítmények előállítására is vonatkozik, amelyek egy (IV) általános képletű vegyületet vagy annak gyógyászati szempontból elfogadható sóját gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal összekeverve tartalmazzák. A daganatellenes hatású készítményt a kívánt adagolási módnak megfelelően bármilyen gyógyszerformában kiszerelhetjük. Ilyenek például az orális adagolás céljára alkalmazható szilárd készítmények, így a tabletták, kapszulák, pilulák, porok és szemcsézett készítmények; az orális adagolás céljára alkalmazható folyékony készítmények, például az oldatok, szuszpenziók, szirupok és elixírek; valamint a parenterális adagolás céljára alkalmas készítmények, így a steril oldatok, szuszpenziók és emulziók. A találmány szerinti gyógyászati készítmények steril, szilárd formában is lehetnek, amelyek steril vízben, fiziológiás konyhasóoldatban vagy más steril, befecskendezhető közegben közvetlenül felhasználás előtt felodhatók. A találmány szerinti eljárást az alábbi, nem korlátozó jellegű kiviteli példákban részletesen ismertetjük. 1. példa 9a-Metoxi-7 {[2-(foszfono-oxi)-etil] -amino}-mitozán-dinátriumsó [(V) képletű vegyület] előállítása 56 mg (0,4 mmól) (2-amino-etil)-dihidrogén-foszfát, 0,35 ml víz és 0,3 ml (2 mmól) trietil-amin oldatát 140 mg (0,4 mmól) mitomicin-A és 6 ml metanol oldatához adjuk, a reakcióé legyet másnapig szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd 1,4 ml telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot adunk hozzá, és utána az oldatot víz és diklór-metán között megoszlatjuk. A vizes fázist szárazra pároljuk, majd többször egymás után metanolt adunk a maradékhoz, és ismét bepároljuk. Az így kapott maradékot metanolban fel vesszük, szűrjük és 2x10 cm méretű C-18 (megfordított fázisú) szilikagél-oszlopra visszük fel. A terméket vízzel eluáljuk, majd az összes illékony anyagot lepároljuk. A maradékhoz a fentiek szerint metanolt adunk, és bepároljuk, az így kapott maradékot 24 órán át foszfor-pentoxid felett igen jó vákuumban szárítjuk. így finom, kék por alakjában 190 mg (97%) cím szerinti vegyületet kapunk. Az 'H-NMR színkép adatai (360 MHz, D2O, 8 ppm): 1,94 (s, 3H, -CH3); 2,9-3,1 (m, 4H); 3,20 (s, 3H, -OCH3); 3,28 (s, 1H); 3,36 (s, 1H); 3,5-3,65 (m, 411); 4,1-4,25 (m, 2H); 4,50-4,57 (dd, 1H, 10-H). Tömegszínkép M+: 503,0912 (a CnH2iN409PNa2 bruttóképletre számítva 503,0920). SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás a (IV) általános képletű vegyületek - ahol alk jelentése 2-4 szénatomos, egyenes vagy elágazó szénláncú alkiléncsoport - és a vegyületek alkálifémsóinak az előállítására, azzal jellemezve, hogy mitomicin-A-t valamely (HO)2P-0-(CH2)2-Ö 4-NH2 általános képletű aminoalkil-dihidrogénfoszfáttal reagáltatunk és kívánt esetben a kapott (IV) általános képletű vegyületet alkálifémsóvá alakítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás alk helyén - (CH2)2- csoportot tartalmazó (IV) általános képletű vegyület és nátriumsója előállítására, azzal jelle5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
