202244. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új vírusellenes hatású purin-származékok és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására
1 HU 202244 B 2 le-féle MEM-ben elkészített tesztanyag hígításokat helyeztünk és minden üregbe 0,5 ml folyadékot öntöttünk feleslegben. A tesztanyagot úgy hígítottuk, hogy 200, 60, 20, 6....0,6 pg/ml-es koncentrációkat kapjuk. A végső koncentráció tehát 100 pg/ml és 0,03 pg/ml között volt. A fertőzött tenyészeteket 37 °C-on inkubáltuk 5% széndioxidot tartalmazó nedvesített atmoszférában, amíg a foltok tisztán láthatóvá nem váltak. (5 vagy 6 nap). Az 1. és 2.tenyészetet formol fiziológiai sóoldatban rögzítettük az agaróz rétegeket óvatosan lemostuk, majd a sejt monofázisokat karbolfukszinnal megszíneztük. A foltok számlálására sztereomikroszkópot alkalmaztunk. Az IC50 a gyógyszernek az a koncentrációja, amely a képződött foltok számát 50%-ban gátolja, a víruskontroll monofázisokban megfigyelt foltok számához képest. Tehát kiszámítottuk a tesztvegyület IC50 értékét, ezen kívül megfigyeltük a monofázisokat gyógyszer által előidézett fitotoxicitásra és feljegyeztük azt a minimális koncentrációt, amelynél feliépet a fitotoxitás. 3. CPE inhibiciós teszt (monofázis) lentivírusokra 3xl04 bárány korroid plexus (SPC) sejteket 96 üregű mikrotiterű lemezbe helyeztük 100 pl Eagle-féle MEM-ben, amely Hank sókat és 10% hőinaktivált magzati borjúszérumot (FCS) tartalmaz. Amikor a monofázisok megállapodtak, azaz egy vagy két napi tenyésztés után, akkor ezeket 200 pl fenntartási közeggel (Eagle- féle MEM Hank sóval, amely 0,5% FCS-t tartalmaz) és 100 pl visna vírussal azaz K184 törzzsel megfertőztük a fenntartási közegben (20 TCID5o/ml). Tesztmintákat a fenntartási közeggel hígítottuk, további 96 üregű mikrotiterű lemezekben 200-0,06 pg/ml koncentrációtartományon belül háromszoros hígítási lépésekkel. A hígított mintákból 100 plitert közvetlenül a vírusfertőzött monofázisokra viszünk át (végső koncentrációtartomány 100-0,03 pg/ml) és 37 °C-on inkubáljuk nedvesített 5%-os széndioxidot tartalmazó mikroatmoszférában, amíg a vírusindukált CPE maximális nem volt a kezeletlen vírusfertőzött konrollokban. Rendszerint 12-14 nap. A lemezeket formálfiziológiai sóval rögzítettük és kristályibolyával megfestettük. Ezután megszámoltuk a virusindukált CPE-t és a minta minimális koncentrációját, amely a sejt monofázisok teljes védelmét nyújtotta (MIC) meghatároztuk. Eredmények IC50 (pg/ml) MIC (pg/ml) Példaszám Herpesz Szimplex vírus Varicella Visna 1. típus 2. típus zoszter vírus vírus HFM törzs MS törzs Ellen törzs KI84 törzs verosejtek- MRC-5 MRC-5 SPC ben sejtekben sejtekben sejtekben 1 >100 >100 100 100 2 >100 69 80 3 3 >100 >100 51 10 4 1,1 0,08 0,06 >0,003 5 59->3 — 7 >100 >100 66 0,3 8 >100 >100 60 1 10 17 7,3 21 >0,003 11 100 >100 30 IC50 (pg/ml) MIC (pg/ml) Példaszám Herpesz Szimplex vírus Varicella Visna 1. típus 2. típus zoszter vírus vírus HFM törzs MS törzs Ellen törzs KI84 törzs verosejtek- MRC-5 MRC-5 SPC ben sejtekben sejtekben sejtekben 12 24 >3 0,3 13 3,7 0,5 >0,03 14 >3 >0,03 >0,03 15 29 >3 — Toxicitás; max. 30 pg/ml koncentrációig egyik vegyület sem bizonyult toxikusnak a sejt monofázisokra egyik tesztben sem. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Eljárás (I) általános képletű vegyület vagy gyógyászatiig elfogadható sója - ahol Rí jelentése hidroxil- vagy aminocsoport, klóratom vagy OR - ahol R.7 jelentése 1-4 szénatomos alkilcsoport R2 jelentése aminocsoport, vagy ha Rt hidroxilvagy amino-, akkor R2 lehet hidrogénatom is, R3 jelentése hidrogénatom vagy hidroxi-metil-csoport, R4 jelentése (a) általános képletű csoport, ahol R5 és Ró egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, 1-4 szénatomos alkilcsoport vagy R3 és R4együtt (c) általános képletű csoportot képez - előállítására, azzal jellemezve, hogy a) egy (II) általános képletű vegyületben imidazol gyűrűt képezünk, ahol X jelentése imidazol gyűrűt képző csoport, előnyösen aminoszármazék, előnyösen formil-amino-csoport, vagy b) egy (III) általános képletű vegyületet pirimidin-gyűrűbe zárunk - ahol Y jelentése amino- vagy 1-6 szénatomos alkoxicsoport - kondezálószerrel, amely pirimidin gyűrű képzésére alkalmas és 2-R’2, szubsztituenst hordoz, Rí helyén hidroxil és R2 helyén aminocsoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyület előállítására, vagy c) egy (IV) általános képletű vegyületet (V) általános képletű oldallánc intermedierrel kondenzálunk- ahol Z jelentése kilépő csoport és adott esetben egy kapott (I) általános képletű vegyületben -ahol, Ri, R2, R3 és/vagy R4 védőcsoporttal van ellátva, ezt eltávolítjuk, előnyösen hidrolízissel vagy dezaminálással vagy kívánt esetben egy kapott (I) általános képletű vegyületben - ahol Rl, R.2, R3 és/vagy R4 halogénatom - a halogénatomot 1-6 szénatomos alkoxi- vagy aminocsoporttá alakítjuk,- ahol fenti szubsztituensek jelentése 1-6 szénatomos alkoxicsoport - hidroxilcsoporttá alakítjuk vagy a fenti csoportok helyén egy a) képletű csoportot c) képletű csoporttá alakítunk. Elsőbbsége: 1988. 11. 30. 2. Eljárás (I) általános képletű vegyület vagy gyógyászatiig elfogadható sója, ahol Rl jelentése hidroxil- vagy aminocsoport, R2 jelentése aminocsoport, vagy ha Rí hidroxilvagy amino-, akkor R2 lehet hidrogénatom is, R3 jelentése hidrogénatom vagy hidroxi-metil-csoport, R4 jelentése (a) általános képletű csoport, ahol R5 és Ró egymástól függetlenül lehet hidrogénatom, 11 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
