201972. lajstromszámú szabadalom • Eljárás tumor ellenes 4'-dezoxi-13(S)-dihidro-4'-jód-doxorubicin-hidroklorid előállítására a 4'-dezoxi-4'-jód-doxorubicin sztereoszelektív mikrobiológiai redukciójával
HU 201972 B tanol 9:1 arányú elegyével extraháljuk. A szerves fázis a (II) képletű FCE 24883-t tartalmazza, az (I) képletű vegyülettel, illetve az antraciklin-vegyületek kisebb móltömegű bomlási termékével együtt. Tisztítási folyamat A szerves extraktumot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk, a diklór-metánban oldott maradékot szilikagél oszlopon kromatografáljuk pH 7- re gradiens elucióval, diklór-metán-metanol-víz rendszerben. Az (I) képletű vegyület eluálódik először 95:5:0,25 arányú elegyben, majd ez követi a (II) képletű FCE 24883 vegyület a 90:10:0,5 arányú eluátumban. Az összegyűjtött frakciókból vizes mosás; nprpanol jelenlétében való bepárlás, ekvivalens mennyiségű sósav és nagy feleslegben való n-hexán adagolás után a (II) képletű FCE 24883 vegyület hidrokloridja csapadék formájában tisztán kinyerhető. Fizikai és kémiai tulajdonságok A (II) képletű FCE 24883 vegyület szabad bázis formájában poláros szerves oldószerekben és vizes alkoholokban oldódik, míg hidrokloridja vízben és alacsony szénatomszámú alkoholokban jól oldódik, de szerves oldószerekben gyakorlatilag oldhatatlan. Az FCE 24883 vegyület hidrokloridjának fiziko-kémiai tulajdonságai a következők: olvadáspont: 200 °C, specifikus forgatóképesség: (alfa)23 d + 180° (0,05 CH3OH), abszorpciós spektrum az UV és látható tartományban: lambdaH20max 232, 254,290 és 480 nm, (E1%icm = 492,370,127,163), infravörös spektrum (KBr) csúcsai: 3400, 2970, 2920,1610,1580,1472,1440,1410,1380,1355,1320, 1235,1210,1110,1080,1060, 1030,1010, 985, 965, 940,920,900,890,870, 860.830,810, 785, 755, 730, 710,540,480,450,415 cm'1; 1H-NMR spektrum (DMSO-de, 200 MHz, 22 °C): 14,03 (bs, 2H, OH-6, OH-11), 7,6-7,9 (m, 3H, H-l, H-2, H-3), 5,26 (m, 1H, H-l’), 4,96 (d, J = 5,2 Hz, 1H, OH-13), 4,92 (m, 1H, H-7), 4,55 (m, 1H, H-4’), 4,51 (t, J = 6,7 Hz, 1H, OH-14), 4,20 (s, 1H, OH-9), 3,97 (s, 3H, 4-OCH3), 3,76 (ddd, J = 3,5, 6,7,11,0 Hz, 1H, CH (H)-OH), 3,60 (dq, J = 1,0, 6,0 Hz, H-5’), 3,48 (ddd, J = 7,2,6,7,11,0 Hz, 1H, CH (H)-OH), 3,37 (ddd, J = 5,2, 3,5, 7,2 Hz, 1H, H-13), 3,02 (m, 1H, H-3’), 2,81 (m, 2H, CH2- 10), 2,15 (dd, J = 2,0,15,3 Hz, 1H, H-8e), 1,97 (dd, J = 6,0,15,3 Hz, 1H, H-8ax), 1,7-1,9 (m, 2H, CH2- 2’) és 1,14 delta (d, J = 6,0 Hz, 3H, CH3-5’); molekulaképlet: C27H3oNJOio.HC1; m/z a szabad bázisra: 656 (MH) +; 655(M)+ és 416(M+) az algikonnak megfelelően. A szelektív nagynyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) módszer lehetővé teszi az (I) képletű vegyületből NaBHt-es redukcióval előállított 4’dezoci-13-dihidro-4’-jód-doxorubicinban jelenlevő két C-13-as sztereoizomer alkohol elkülönítését; a két megfelelő csúcs retenciós ideje rendre 18,8, illetve 19,3 perc. Ugyanezzel a HPLC-es módszerrel a (II) képletű FCE 24883 vegyület önálló csúcsként jelentkezik 3 19,3 perces retenciós idővel, mely a szintetikus C- 13-as izomerek (dihidro-származékok) közül a lassabban mozgó izomernek felel meg. A HPLC-s módszer leírása Oszlop: két RP Spherisorb S30DS2 (C18 3 p., Phase Separation, Nagy-Britannia) 150 x 4,5 mm. Hőmérséklet: 45 °C. Mozgó fázis A: 0,05 M vizes KH2P04 (a pH-ja 1M H3P04-gyel 3,0-ra állítva) és metanol 80:20 arányú (tf) elegye; B: metanol. Elució: 30 percen át izokratikus (42% A + 58% B)' 3 Térfogat áram: 0,6 cm /perc. Detektálás: 254 nm-en. Szerkezet értelmezés A (II) képletű vegyület savas hidrolízisével (0,2 N vizes HCl-ben, 80 °C-on, 30 percen át) nyerhető a (III) képletű ágiikon vörös csapadékja, miközben a (IV) képletű 3-amino-2,3,4,6-tetradezoxi- 4-jód-L-lixohexohexoz, mely a (II) képletű vegyület cukor komponense, a vizes fázisban oldva van jelen. Ezt a vegyületet az (I) képletű vegyület savas hidrolízise útján előállított autentikus mintával való összehasonlítás útján azonosíthatjuk. A (III) képletű vegyület C-13 szénatomjának abszolút (S) konfigurációját a Pneco, S. és munkatársai által a Gazzetta Chimica Italiana, 115, 195, 1985-ben leírtak alapján nyert autentikus 13-(S)-dihidro-adriamicinen 9,13-0-izopropilidén-14-0-tbutil-difenil-szilil-származékának és a (III) képletű vegyület 9,13-0-izopropilidén-14-0-t-butil-difenil-szilil-származékának direkt összehasonlításával (1H-NMR és tömegspektroszkópia és VRK) állapítottuk meg. Biológiai aktivitás (Vizsgálati módszer: The Journal of Antibiotics, Vd. XXXV. No.2.176-183. old.) A (II) képletű FCE 24883 vegyület citosztatikus aktivitását mértük in vitro HeLa és P388 sejteken összehasonlítva az (I) képletű vegyület és a doxorubicin citosztatikus aktivitásával. Az I. táblázat adatai alapján a (II) képletű vegyület a doxorubicinhez, illetve a 4’-dezoxi-4’-jód-doxorubicinhez (I) hasonlóan hatékonynak bizonyult. A (II) képletű FCE 24883 vegyület in vivo tumorellenes hatását kiterjedt Gross leukémia ellen vizsgáltuk. C3H egereket oltottunk be 2 x 106 sejt/egér koncentrációban, majd az intravénás tumor-injekciót követően 24 óra múlva kezeltük a vizsgált vegyületekkel. AII. táblázat két kísérlet eredményeit mutatja. Az optimális dózis esetén a (II) képletű vegyület hatásosabbnak bizonyult a doxorubicinnál, és hatása összevethető volt az (I) képletű 4’-dezoxi-4’-jóddoxorubicinnal, ugyanakkor a hatásos dózisban a toxicitása kisebb. A (II) képletű vegyülettel kezelt és kontroll egerek túlélési ideje alapján becsült tumor-ellenes aktivitás összevethető az (I) képletű vegyületre, illetve a doxorubicinra kapott aktivitásértékekkel. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
