201966. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hialuronsav-észterek és sóik, ezeket hatóanyagként vagy hordozóként tartalmazó gyógyszerkészítmények, valamint hialuronsav-észterekből képzett filmek és szálak előállítására
HU 201966 B dójával kapott alapvető savakat tartalmazó molekula-frakciókat tartalmazzák, amelyek molekulatömege tág határok között változhat, például a 13 milliós molekulatömegű alapsav molekulatömegének mintegy 90-80%-a (molekulatömeg: 11,7-10,4 millió) és 0,2%-a (molekulatömeg: 30.000) között, előnyösen 5-0,2%-a között. Ilyen frakdók különböző, az irodalomból ismert eljárásokkal állíthatók elő, így hidrolízissel, oxidációval, enzimatikus és fizikai eljárásokkal, például mechanikai vagy besugárzási eljárásokkal. Az extrakciós eljárásokkal kapcsolatban hivatkozunk Balázs és munkatársai a „Cosmetics and Toiletries” folyóiratban megjelent, korábba^ említett cikkére. A különböző molekulasúlyú frakciók elkülönítése és tisztítása ismert technikákkal történhet, például molekulaszűréssel. A HYrnak egy, a találmány szerint alkalmazható frakciója például a „nem-gyulladáskeltő-NIF-Na- HA”-nátrium-hialuronát”-nak nevezett frakció, amelyet Balázs a „Healon” kiadványban ismertetett (A guide to its use in Ophthalmic Surgery, D. Miller and R. Stegmann, eds. John Wiley and Sons, N. Y. 81983,5). A találmány szerinti észterek különösen értékes kiindulási anyaga az a két tisztított frakció, amely a hialuronsavból, például a kakastaréj-éeredetű hialuronsavból állítható elő és a „Hyalastine” illetve „Hyalectine” nevet viseli. A Hyalastine frakció átlagos molekulatömege körülbelül 50.000-100.000, míg a Hyalectin átlagos molekulatömege körülbelül 500.000-730.000. E két frakció kombinációját is izolálták, és jellemezték. Úgy találták, hogy átlagos molekulatömege 250.000-350.000. Ez a kombinált frakció a megfelelő kiindulási anyagban jelen levő teljes hialuronsav mennyiségére számítva 80%-os hozammal, a Hyalastine 50%-os hozammal állítható elő, a kiindulási HY mennyiségre számítva. E frakciók előállítását az A-C példákban ismertetjük. A HY-ból a találmány szerinti speciális észterezési eljárás kiindulási anyagaiként szolgáló fémsókat ismert módon, például úgy állítjuk elő, hogy a HY-t szápiított mennyiségű bázissal reagáltatjuk, így például alkáli-hidroxidokkal vagy a megfelelő fémek bázisos sóival, így karbonátjaival vagy hidrogén-karbonátjaival. A találmány szerinti részleges (parciális) észterekben valamennyi szabadon maradt karboxilcsoport vagy ezek egy része sóvá alakítható, annak megfelelően, hogy a bázist milyen mennyiségben használjuk. A sóképzés fokának megfelelő beállításával különböző disszociációs állandójú észterek széles skálája állítható elő, amelyek oldat formájában vagy „in situ”, a gyógyászati alkalmazás helyén a megfelelő pH-t biztosítják. A találmány szerinti új termékek közül különösen fontosak a fent ismertetett észterek és sóik, és azok, amelyeket a következő, szemléltető jellegű példákban írunk le. A találmány kiterjed az új észterek és sóik olyan módosított előállítási eljárására is, amelyet egy adott szinten megszakítunk vagy egy intermedierből kiindulva hajtunk végre a hátralevő lépéseket, vagy amelyben a kiindulási anyagok in situ keletkeznek. A találmány további részleteit a következő pél17 dákkal szemléltetjük anélkül, hogy találmányunkat a példákra korlátoznánk. Előállítási példák A következő A-C. példák a találmány szerinti eljárásban különösen előnyösen alkalmazható hialuronsav frakciók előállítását muatják be. A. példa A gyulladáskeltő hatással nem rendelkező Hyalastine és Hyalectine frakciók elegyének előállítása 3000 g friss vagy fagyasztott kakastaréjt húsdarálóban megdarálunk, majd mechanikai homogenizátorral óvatosan homogenizálunk. Az így kapott pépet SISI316 rozsdamentes acél tartályba vagy üveg tartályba helyezzük, és 10 térfogat vízmentes acetonnal kezeljük. Az egészet 6 órán át keverjük 50 fordulat/perc sebességgel. 12 órán át a fázisokat hagyjuk elkülönülni, és az acetont leszívatjuk. Az acetonos extrahálást mindaddig ismételjük, míg az eltávolított aceton megfelelő mértékű nedvességet ér el (Karl-Fischer módszer). Ezután az egészet centrifugáljuk, vákuumban, megfelelő hőmérsékleten 5-8 órán át szárítjuk. így körülbelül 500-600 g száraz, porított kakastaréjt kapunk. A száraz por 300 g-ját enzimatikusan emésztjük 0,2 g pápámnál, vizes körülmények között, a pH beállításához alkalmas mennyiségű cisztein-hidroklorid jelenlétében foszfát puffert használva. A kapott anyagot 24 órán át 60 fordulat/perc sebességgel keverjük, a hőmérsékletet 60-65 °C-on tartva. Ezután lehűtjük 25 °C- ra, és Celite -t (60 g) adunk hozzá, a keverést további egy órán át fenntartva. A kapott elegyet addig szűrjük, míg tiszta folyadékot nem kapunk. A tiszta folyadékot ezután molekuláris ultraszűrésnek vetjük alá, 30.000-es kirázási hatású molekulaszűrőt használva annak érdekében, hogy a membránon a 30.000-nél nagyobb molekulatömegű molekulák maradjanak fenn. A terméket az eredeti térfogat 5-6-szereséből ultraszűrjük, az ultraszűrés alatt folyamatosan desztillált vizet adva a termékhez. Megszüntetjük a víz hozzáadását, és az ultraszűrést addig folytatjuk, míg a térfogat az eredeti 1/3-ára csökken. A visszamaradó folyadékot nátrium-klorid hozzáadásával 0,1 mólosra állítjuk be, és a hőmérsékletet 50 °C-ra emeljük. 60 fordulat/perc sebességgel történő keverés mellett 45 g cetil-piridinium-kloridot adunk hozzá. 60 percen át keverjük, majd 50 g CeliteR-t adunk hozzá. Keverés közben az elegy hőmérsékletét 35 °C-ra állítjuk be, és a centrifugálás hatására kivált csapadékot összegyűjtjük. A csapadékot 5 liter 0,01 mólos vizes nátrium-klorid oldatban szuszpendáljuk, amely 0,05% cetil-piridinium-kloridot tartalmaz. A kapott szuszpenziót 60 percen át 50 °C-on keverjük, majd a hőmérsékletet 25 °C-ra állítjuk be, és a csapadékot centrifugáljuk. A mosási műveletet háromszor megismételjük, majd a precipitátumot összegyűjtjük 3 liter, 0,65 mólos nátrium-kloridot és 0,05% cetil-piridinium-kloridot tartalmazó edényben. Az elegyet 60 fordulat/perc sebességgel 60 percen át keveijük, és a hőmérsékletet két órán át állandó, 25 °C-on tartjuk. A felülúszót centrifugálással eltávolítjuk. Az eljárást néhányszor megismételjük 0,05% cetil-18 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 10
